Герпесвирусные векторы
Первый герпесвирусный вектор был получен от Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) - обволакивающего вездесущего вируса с двухцепочечным линейным геномом ДНК. Отличительными признаками HSV-1 являются короткий цикл репликации и способность к ретроградному аксональному транспорту от первичного места заражения к сенсорным нейронам ЦНС, где он устанавливает пожизненную латентность в эпизомной форме.
С тех пор были разработаны три типа векторов, основанных на HSV-1:
- векторы репликации-компетентные
- векторы репликации-дефектные
- векторы ампликона
Репликационно-компетентные векторы используются в онкологии для обеспечения их способности завершить литический цикл в присутствии разрешительных клеточных сред. Тестирование дефектных и ампликонных векторов репликации в качестве средств передачи генов для ЦНС.
Большой ген (152 кб) HSV-1 кодирует около 80 генов, половина из которых может быть удалена, чтобы освободить место для до 50 кб чужеродной ДНК в случае дефектных векторов репликации и до 150 кб для ампликонных векторов.
Векторы HSV-1 поддерживают высокую инфекционность, способность как ретроградного, так и антероградного транспорта, а также возможность установления латентной инфекции в эпизомной форме. Традиционными ограничениями в их применении являются остаточная токсичность по отношению к инфицированным клеткам и кратковременная экспрессия трансгена из-за механизмов быстрого затухания.
Новые векторы на основе HSV для получения кассет с множественной экспрессией
Расстройства ЦНС часто не являются результатом мутации одного гена или одного молекулярного механизма, а имеют многофакторное происхождение. В результате, терапевтический ген (гены) и/или регуляторная последовательность, которая должна быть доставлена, очень часто превышают грузоподъемность вирусных векторов. Векторы HSV-1 представляют собой привлекательное решение этой проблемы в силу их большого геномного размера и способности принимать большое количество чужеродной ДНК. Однако, как отмечалось выше, первым поколениям векторов с дефектом репликации HSV-1 препятствовали весьма существенные ограничения, включая токсичность и кратковременную экспрессию трансгенов. Многие недавние исследования были направлены на решение этих проблем.
Продуктивный цикл HSV характеризуется временно регулируемым каскадом экспрессии генов, в течение которого последовательно экспрессируются три различных класса транскриптов.
Сначала экспрессируются немедленные ранние гены (IE или α), затем ранние (E или β) и поздние (L или γ). IE гены необходимы не только для установления литического репродуктивного цикла, но и для преодоления врожденных иммунных реакций, для блокирования деления клеток, а также для предотвращения апоптоза клеток хозяина и эпигенетического подавления вирусных генов. Инжиниринг мутантных векторов HSV-1, лишенных α-генов, приостанавливает репликацию вирусов и заметно снижает цитотоксичность. Удаление двух генов IE, ICP4 и ICP27, привело к появлению первого (ΔICP4) и второго (ΔICP4/27) векторов HSV-1. Эти ранние поколения смогли установить долгосрочную экспрессию без способности к реактивации, но остаточное присутствие ICP0 отвечало за цитотоксические эффекты в индуцированных клетках.
Последующее удаление ICP0 привело к появлению третьего поколения векторов, лишенных токсичности, но демонстрирующих кратковременную экспрессию трансгена. Для преодоления этого препятствия было разработано новое поколение векторов HSV-1, которое вставило кассету с экспрессией трансгена в вирусный латентно-ассоциированный транскриптовый локус - область генома, защищенную от затухания во время латентности наличием изоляторных последовательностей (CTRL), которые действуют в качестве граничных элементов для защиты локуса от эпигенетических модификаций.
Это новое поколение высокодефектных векторов обладает большой грузоподъемностью при отсутствии признаков токсичности при заражении in vitro различных типов клеток. Инъекция этого нового класса HSV-векторов в различные области мозга наивных крыс дала надежную и устойчивую (до 6 месяцев) нейронспецифическую экспрессию трансгенов, вставленных в локус ICP4, без доказательств токсичности или воспалительной инфильтрации клеток, что позволяет предположить, что локус ICP4 может быть вариантом для достижения устойчивой и длительной экспрессии трансгена в нейронах. Дальнейшая модификация вирусной основы (удаление гена UL41, который может способствовать остаточной токсичности) еще больше повысила уровень экспрессии трансгена. Удаленные по UL41 векторы демонстрировали улучшенную, долговременную и нейроспецифичную экспрессию трансгена без каких-либо доказательств токсичности.
Продолжение...