Коронавирусы это оболочечные вирусы с одноцепочечной «плюс» РНК, с размерами генома от 25 до 32 тыс. нуклеотидов, вызывающие респираторные и кишечные заболевания животных и человека. В обзоре рассмотрены случаи заболевания человека, вызванные новым коронавирусом (NCoV), возможные естественные резервуары возбудителя, механизмы передачи инфекции, некоторые характеристики этиологического агента заболевания, методы диагностики и идентификации возбудителя, полная последовательность генома и связь NCoV с известными коронавирусами.
УДК 578.834.1
Л.Ф.Стовба, В.Н.Лебедев, А.А.Петров, В.М.Ручко, В.С.Кулиш, С.В.Борисевич
новый коронавирус, вызывающий заболевание человека
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны,
Сергиев Посад, Российская Федерация
Коронавирусы - это оболочечные вирусы с одноцепочечной «плюс» РНК, с размерами генома от 25 до 32 тыс. нуклеотидов, вызывающие респираторные и кишечные заболевания животных и человека. В обзоре рассмотрены случаи заболевания человека, вызванные новым коронавирусом (NCoV), возможные естественные резервуары возбудителя, механизмы передачи инфекции, некоторые характеристики этиологического агента заболевания, методы диагностики и идентификации возбудителя, полная последовательность генома и связь NCoV с известными коронавирусами.
Ближневосточный респираторный синдром человека (Middle East Respiratory Syndrome - MERS) -новое особо опасное инфекционное заболевание, вызываемое представителем рода бетакоронавирусов.
В июне 2012 г. в клинику города Джидда был госпитализирован с острой пневмонией и почечной недостаточностью подданный Саудовской Аравии. В результате молекулярно-биологического изучения биопроб выделили новый коронавирус [44]. В сентябре 2012 г. от второго больного (подданного Саудовской Аравии), который путешествовал по территории Катара и был госпитализирован в клинику Лондона, идентифицирован этот же возбудитель [5]. Секвенирование ампликона в Медицинском центре Эразма (EMC) в городе Роттердам (Нидерланды) из проб первого больного позволило открыть новый патогенный для человека возбудитель, названный вирусом Ближневосточного респираторного синдрома - MERS-CoV (ранее встречающееся в литературе название - HCoV-EMC) [12]. Важно отметить, что после идентификации нового коронавируса специалистами NAMRU-3 ретроспективно изучены биопробы от людей в Иордании, погибших в марте-апреле 2012 г., и установлен факт их гибели именно от этого возбудителя [19].
C тех пор было зарегистрировано 182 случая Ближневосточного респираторного синдрома (таблица), 79 из которых закончились смертельным исходом (летальность 43,4 %).
Заболевание зарегистрировано в 6 странах
Аравийского полуострова, в основном в Саудовской Аравии. Также выявлено 12 завозных случаев в Европе (Великобритания, Германия, Франция, Италия, Испания) и Северной Африке (Тунис).
Свыше 80 % от всех заболеваний зарегистрированы в Саудовской Аравии (в 6 из 13 провинций)
Регистрация случаев Ближневосточного респираторного синдрома (MERS) у людей в мире (по состоянию на 7 февраля 2014 г.)
Государство Количество, чел. Летальность, %
заболевших погибших
Заболеваемость на эндемичной территории
Саудовская Аравия 146 62 42,1
Катар 9 3 33,3
ОАЭ 7 3 42,9
Оман 3 3 100,0
Иордания 3 3 100,0
Кувейт 2 0 0
Всего: 170 74 43,5
Завозные случаи инфекции
Великобритания 3 2 66,7
Германия 2 1 50,0
Франция 2 1 50,0
Тунис 3 1 33,3
Италия 1 0 0
Испания 1 0 0
Всего: 12 5 41,7
Итого: 182 79 43,4
[2]. Тем не менее, данные серологических исследований, проведенных A.M.Zaki et al. [44], говорят об отсутствии циркуляции вируса среди населения этой страны. Группой повышенного риска являются люди с выраженным иммунным дефицитом или хроническими почечными или легочными заболеваниями. Так, во время самой большой вспышки MERS в г. Аль-Ахза в Саудовской Аравии заболело 23 человека [9]. У 74 % из них был диабет, у 52 - почечная недостаточность, у 43 - легочная недостаточность.
Инкубационный период заболевания, вызванного этим коронавирусом, составляет около 5 сут [3, 6].
В ходе проведенных эпидемиологических исследований выявлено не менее 8 кластеров заболевания, что позволяет считать доказанной возможность передачи инфекции от человека к человеку [11]. Передача вируса членам семей заболевших и медицинским работникам зафиксирована в 1-2 % случаев, что ниже, чем для других респираторных коронавирусов, выделенных от человека, в том числе и вируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС). Согласно последним данным, при вторичных контактах, т.е. у людей, заразившихся от первичного случая, заболевание протекает легче [3].
Наиболее вероятный путь передачи инфекции от человека к человеку - респираторный [20], что потенциально определяет возможность возникновения эпидемической вспышки с высокой летальностью. Случаи MERS в Англии, Франции, Германии, Италии и Тунисе отмечены у людей, посещавших Ближний Восток. Глобальный характер миграции людей в наше время может стать причиной появления MERS и на других континентах.
Этиологическим агентом Ближневосточного респираторного синдрома является коронавирус, выделенный от человека. Согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов MERS-CoV является представителем группы С рода Betacoronavirus, подсемейства Coronavirinae, семейства Coronaviridae, порядка Nidovirales [20, 21, 22].
Возбудитель генетически близок к различным коронавирусам, выделяемым от летучих мышей, обитающих в Африке и Европе. По мнению многих ученых, его резервуаром могут быть летучие мыши, относящиеся к родам Rousettus, Tylonycteris и Pipistrellus [22, 24]. Имеется гипотеза о том, что предок MERS-CoV может существовать в насекомоядных летучих мышах Старого Света, принадлежащих к семейству Vespertilionidae, к которому принадлежат роды Neoromicia и Pipistrellus, и имеет африканское происхождение. Предполагаемый перенос предшественника MERS-CoV из Африки на Аравийский полуостров происходил параллельно переносу других возбудителей (например, вируса лихорадки долины рифт из Восточной Африки, что привело к вспышке заболевания в Саудовской Аравии в 2000 г.) [18].
Поскольку есть данные о выделении MERS-CoV от верблюдов дромадеров, то не исключен механизм формирования эпидемического очага, при
котором резервуар возбудителя находится в насекомоядных летучих мышах, а промежуточным хозяином является такое синантропное животное как верблюд, который и представляет собой источник инфицирования человека. это подтверждается тем фактом, что многие зарегистрированные первичные случаи MERS связаны с контактами заболевших с верблюдами [29, 35].
определение потенциальной циркуляции MERS-CoV у верблюдов дромадеров показывает, что оба типа трансмиссии - зоонозный и от человека к человеку - вовлечены в передачу вируса [23, 24].
Генетическая изменчивость MERS-CoV обеспечивается высокой частотой рекомбинации РНК коронавирусов и способностью их больших геномов получать и терять домены [13, 24, 38]. Эти факторы способствуют появлению вирусов с новыми свойствами, которые способны адаптироваться к новым хозяевам и экологическим нишам, что служит иногда причиной эпидемий и эпизоотий.
Геном MERS-CoV представлен одноцепочечной «плюс» РНК, состоящей из 30119 нуклеотидов [11]. Гомология между изолятами, выделенными при первом зарегистрированном случае Ближневосточного респираторного синдрома человека в Саудовской Аравии и Англии, составляет 99,67 % (30021 нукле-отид из 30119) [28]. Геном включает 5 открытых рамок считывания, 4 из которых (расположенные, начиная с 5'-конца молекулы РНК, содержащие гены РНК-зависимой РНК-полимеразы и неструктурных вирусоспецифических белков) обладают высокой степенью гомологии. основные различия в структуре генома между коронавирусами, представляющими одну и ту же монотипичную линию, наблюдаются в пределах открытой рамки считывания, расположенной около 3'-конца молекулы РНК. Гены неструктурных белков репликативного комплекса занимают две трети генома и транслируются в большой полипротеин, состоящий из 16 белков. Эти гены консервативны для всех коронавирусов. Так, при сравнении рассчитанной первичной структуры 16 неструктурных белков изолятов из Саудовской Аравии и Англии у 11 отсутствуют различия по предполагаемой первичной структуре белка, а у 5 (белки NSP2, NSP3, NSP4, NSP13 и NSP15) уровень различий не превышает 0,3 %.
Гены структурных белков, подобно другим ко-ронавирусам, расположены на 3'-конце генома и включают ген нуклеокапсидного белка (N) с молекулярной массой (ММ) ~50 кДа, ген гликопротеина (S) с мм ~90 кда и гены двух мембранных белков (мембранного гликопротеина (М) с ММ ~23 кда) и малого оболочечного белка (Е) с ММ ~23 кДа. Кроме четырех основных генов структурных белков, существуют еще пять генов дополнительных белков, уникальных для MERS-CoV. они имеют высокий уровень гомологии с аналогичными белками коронавирусов летучих мышей BtCoV-HKU4 и BtCoV-HKU5 [11].
Коронавирусы экспрессируют экзорибонуклеа-
зу, являющуюся неструктурным белком (nSP-14). Этот фермент необходим для обеспечения точности репликации и является высококонсервативным в пределах рода. Все биохимические и генетические данные подтверждают необходимость nSP-14 для считывания РНК. Последовательность РНК, кодирующая nSP-14, является ответственной за чувствительность к мутагенам. В частности, MERS-CoV резистентен к рибаверину и 5-фторурацилу [37].
Поскольку за адсорбцию и проникновение ко-ронавирусов в клетку отвечает гликопротеин S, который обусловливает круг хозяев и индукцию синтеза вируснейтрализующих антител, изучение данного белка MERS-CoV является приоритетным направлением. В связи с тем, что этот структурный белок играет такую важную роль в вирусной инфекции, он будет идеальной мишенью как при исследованиях по идентификации нейтрализующих антител с целью разработки вакцины, так и при исследованиях вирусных ингибиторов [29, 36].
Идентификация хозяйского клеточного рецептора, используемого MERS-CoV, обеспечит понимание патогенеза заболевания и позволит предложить эффективные способы лечения. Установлено, что рецептором для вхождения MERS-COV в клетки служит дипептидил пептидаза-4 (DPP4) [32], в отличие от вируса ТоРС, который использует как рецептор ангиотензин-превращающий фермент 2 (АСЕ2) [7]. DРР4 как рецептор для MERS-CoV был идентифицирован уже через 6 мес. после первого сообщения о выделении вируса [42]. DРР4 служит рецептором MERS-CoV как в клетках человека, так и в клетках летучих мышей, что является косвенным свидетельством возможности прямой передачи вируса в данной экологической цепочке [36]. Подобные молекулы используются и другими коронавирусами для внедрения в клетки.
Снижение содержания DРР4, которое отмечается в ходе инфицирования MERS-CoV, может влиять на состав иммунных клеток и утяжелять течение заболевания. DРР4 также расположен на иммунных клетках, включая Т-лимфоциты, и необходим для нормального их функционирования [43]. В то же время нет достаточных доказательств, что данные клетки играют значимую роль в патогенезе MERS.
Как и другие коронавирусы, MERS-CoV может мутировать в направлении адаптации к клеткам человека. Во время эпидемии ТоРС в 2002-2003 гг. установлено, что мутации, направленные на адаптацию возбудителя в человеческой популяции, группируются в области гена поверхностного гликопротеина, включая области, отвечающие за связывание с рецептором человека ACE2 [15]. Вполне вероятно, что геном MERS-CoV может подвергнуться мутациям, которые усилят его способность передаваться от человека к человеку и реплицироваться в инфицированных индивидах. Установлено, что мутация в гене S гликопротеина, приводящая к замене всего лишь одной аминокислоты в положении 1015 (аспарагин^-треонин), обеспечива-
ет существенное расширение спектра чувствительных культур клеток.
При инфицировании человека MERS-CoV реплицируется в гладких эпителиальных клетках дыхательных путей (HAE), альвеолярных пневмоцитах II типа, микрососудистых эндотелиальных клетках, легочных фибробластах, причем наиболее эффективная репликация происходит в клетках HAE и культуре легочных фибробластов, затем следуют пневмо-циты II типа и наименее эффективно вирус реплицируется в микрососудистых эндотелиальных клетках. При идентичных условиях вирус ТОРС эффективно реплицировался только в культурах клеток HAE. При инфицировании наблюдается быстро повышающийся синтез вирусной РНК и высвобождение вирусного потомства в высокой концентрации, что обусловливает цитопатическое действие (ЦПД). Уровень накопления возбудителя в клетках HAE достигает величин от 1,0 106 до 1,0 107 БОЕ/мл спустя 30 ч после инфицирования [8].
Для накопления возбудителя с целью последующей его идентификации используются постоянные культуры клеток почки африканской зеленой мартышки линии Vero и мышиных фибробластов (LLC-MK2). Электронная микроскопия инфицированных Vero клеток показала экстенсивные мембранные перестановки, в том числе и образование двухмембранных везикул. Индуцированное MERS-CoV цитопатическое действие (при множественности инфицирования от 0,1 до 10 ЦПД50 на клетку) развивается на 7-14-е сутки. Уровень накопления возбудителя в данных культурах клеток превышает 1,0107 ЦПД50/мл [41].
Van Boheemen N. et al. [41] провели изучение ре-пликативного цикла MERS-CoV в клетках Vero и ге-патомы печени человека (Huh7). После репликации геномной РНК происходит трансляция репликазно-го полипротеина, впоследствии расщепляющегося на 16 неструктурных белков [17]. Они направляют дальнейшую репликацию генома и синтез субгеномных мРНК, с которых происходит трансляция структурных белков. В обеих клеточных линиях РНК определялась через 7 ч, и ее концентрация достигала максимума через 13 ч после инфицирования. далее концентрация РНК в клетках Vero оставалась на более или менее постоянном уровне до 24 ч, а в клетках Huh7 наблюдалось снижение, что обусловливало более быстрое развитие цитопатологии в этой клеточной линии между 12 и 24 ч после инфицирования. титры вируса в клетках Vero достигали значений от 5-105 до 5-107 БОЕ/мл. Из клеток Huh7 вирусное потомство высвобождалось значительно раньше, хотя окончательные титры через 24 ч были сравнимы с наблюдаемыми в клетках Vero.
Инфицирование многими коронавирусами может индуцировать образование синцития, обусловленного физиологической активностью вирусного шипикового белка при нейтральном рН [4]. В клетках Vero и карциномы легких человека (Calu3/2B4),
инфицированных различными коронавирусами, отчетливо выраженное ЦПД развивается на 2-й день после инфицирования, на 3-и сутки происходит полное разрушение монослоя клеток. В противоположность этому у клеток Vero E6, инфицированных MERS-CoV, только на 3-и сутки развивается умеренное ЦПД, а неполную гибель клеток наблюдают через 6 сут. Развитие ЦПД в инфицированных MERS-CoV Huh7 клетках происходит быстрее, чем в 3 других сравниваемых клеточных линиях (Calu3/2B4, Vero и Vero E6), образуется синцитий, а разрушение происходит через 17 ч. При небольшой множественности инфицирования образование синцития в клетках Huh7 является важным фактором в развитии ЦПД. Наличие экспрессии DPP4 в клетках Vero и Huh7 и уровни этой экспрессии коррелируют с чувствительностью клеток к MERS-CoV [34].На этом все.