В течение 10 месяцев Леонардо путешествовал по территориям кондотьеров и проводил их обследование. В ходе своей деятельности он набросал некоторые планы города и топографические карты, создавая ранние примеры аспектов современной картографии. При дворе Чезаре Борджиа Леонардо также встретился с Никколо Макиавелли, который был временно размещен там в качестве политического наблюдателя за городом Флоренция.
Весной 1503 года Леонардо вернулся во Флоренцию, чтобы провести экспертную оценку проекта, который пытался перенаправить реку Арно за Пизой так, чтобы город, тогда находившийся в осаде флорентийцами, был лишен доступа к морю. План оказался неработоспособным, но деятельность Леонардо заставила его рассмотреть план, впервые выдвинутый в 13 веке, по строительству большого канала, который бы обходил неприступный участок Арно и соединял Флоренцию с морем. Свои идеи Леонардо развил в серии исследований; используя собственные панорамные виды на берег реки, которые можно рассматривать как пейзажные наброски большого художественного очарования, и используя точные измерения местности, он составил карту, на которой был показан маршрут канала (с его прохождением через горный перевал Серравалле). Проект, рассматриваемый снова и снова в последующие века, так и не был осуществлен, но спустя столетия по точному маршруту, выбранному Леонардо для канала, была построена скоростная магистраль от Флоренции до моря.
Также в 1503 году Леонардо получил заказ на роспись фрески для зала заседаний флорентийского Дворца Веккьо; историческая сцена монументального масштаба (при 7 × 17 метров, она была бы в два раза больше, чем Тайная вечеря). В течение трёх лет он работал над "Битвой при Ангиари"; как и предполагаемая дополняющая ее картина, "Битва при Кашине" Микеланджело, она оставалась незавершенной. В эти же годы Леонардо написал картину "Мона Лиза" (ок. 1503-19 гг.).
Второй флорентийский период был также временем интенсивных научных исследований. Леонардо проводил диссекции в больнице Санта-Мария Нуова и расширил свою анатомическую работу до всестороннего изучения строения и функции человеческого организма. Он проводил систематические наблюдения за полетом птиц, о котором планировал написать трактат. Даже его гидрологические исследования "о природе и движении воды" расширились на исследования физических свойств воды, особенно законов течений, которые он сравнивал с законами, относящимися к воздуху. Они также были изложены в его собственном собрании данных, содержащихся в так называемом "Хаммере Кодекса" (ранее известном как "Кодекс Лестера", в настоящее время находящемся в собственности предпринимателя-программиста Билла Гейтса в Сиэтле, штат Вашингтон, США).
Второй миланский период (1508-13 гг.).
В мае 1506 года Шарль д'Амбуаз, французский губернатор в Милане, спросил у Синьории во Флоренции, может ли Леонардо поехать в Милан. Синьория отпустила Леонардо, и монументальная битва при Ангиари осталась незавершенной. Неудачные технические эксперименты с красками, кажется, заставили Леонардо прекратить работу над фреской; иначе нельзя объяснить его отказ от этого великого произведения. Зимой 1507-08 годов Леонардо отправился во Флоренцию, где помог скульптору Джованни Франческо Русти выполнить свои бронзовые статуи для флорентийского баптистери, после чего поселился в Милане.
Уважаемый и восхищаемый своими щедрыми покровителями в Милане, Шарлем д'Амбуазом и королем Людовиком XII, Леонардо пользовался своими обязанностями, которые ограничивались, главным образом, консультированием по архитектурным вопросам. Наглядным свидетельством такой работы являются планы дворца-виллы для Карла, и считается, что он сделал несколько эскизов оратории для церкви Санта-Мария Алла Фонтана, которую финансировал Карл. Леонардо также рассматривал старый проект, возрожденный французским губернатором: реку Адда, которая бы связала Милан с озером Комо по воде.
Во время этого второго периода в Милане Леонардо мало что создавал как художник. Леонардо снова собрал вокруг себя учеников. Из своих старших учеников Бернардино де' Конти и Салаи снова были в его мастерской; появились новые ученики, среди которых Чезаре да Сесто, Джампетрино, Бернардино Луини и молодой дворянин Франческо Мелци, самый верный друг и компаньон Леонардо до самой смерти художника.
За это время Леонардо получил важное поручение. Джан Джакомо Тривульцио победоносно вернулся в Милан в качестве маршала французской армии и горького врага Людовико Сфорца. Он поручил Леонардо вылепить свою гробницу, которая должна была принять форму конной статуи и быть помещена в часовню морга, подаренную Тривульцио церкви Сан-Назаро Маджоре. После многих лет подготовительных работ над памятником, для которых сохранился ряд значительных эскизов, маршал сам отказался от плана в пользу более скромного. Это был второй прерванный проект, с которым Леонардо столкнулся как скульптор.