Дофамин ослабляет липополисахарид-индуцированную экспрессию провоспалительных цитокинов путем ингибирования...

Продолжение

Хорошо известно, что допамин генерирует супероксидные анионы и хинон допамина путем его автоокисления ( Klegeris et al., 1995). Полученный хинон дофамина становится ковалентно конъюгированным с сульфгидрильной группой цистеиновых остатков белков (Kuhn et al., 1999; Whitehead et al., 2001 ), приводя преимущественно к образованию хинопротеинов ( Graham, 1978 ; Fornstedt et al., 1986). Антиоксидант NAC, как известно, ингибирует окисление дофамина до хинона дофамина, очищает свободные радикалы, такие как гидроксильные радикалы, и ингибирует образование хинопротеинов путем связывания с хиноном дофамина ( Pedrosa and Soares-da-Silva, 2002 ; Khan et al., 2003; Izumi et al., 2005). Поэтому для выявления участия супероксидных анионов и дофаминхинона в эффектах дофамина нами было изучено влияние NAC на дофамин-индуцированное ослабление ЛПС-индуцированной экспрессии цитокинов. NAC (10 мм) был эффективен в обращении вспять этого ослабления ЛПС-индуцированной мРНК и белковой экспрессии цитокинов, вызванных 30 мкм дофамина ( Рис.2). 3 А-Ф). С другой стороны, предварительная обработка клеток Н2О2 (10-100 мкм) не была эффективной, как и комбинация ксантиноксидазы (1-10 МЕ/мл ) и гипоксантина (50 мкм), который генерирует супероксидные анионы ( Рис.2). 3 G-I).

3. Дофамин аттенуировал LPS-индуцированную экспрессию мРНК цитокинов через образование дофаминхинона в клетках BV-2 (A-F) клетки BV-2 обрабатывали в течение 24 ч 30 мкм дофамином (DA) в отсутствие или присутствии 10 мм NAC. (G–I) также другие клетки БВ-2 обрабатывали перекисью водорода или 50 мкм гипоксантином (HX) в сочетании с ксантиноксидазой (XO) в указанных концентрациях в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали 10 мкг/мл ЛПС в течение 9 ч. уровни мРНК ФНО-α (А, Г), Ил-1β (В, Н) и ИЛ-6 (С, I) исследовали методом РТ-ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК цитокинов нормализовался до уровня мРНК β-актина и был выражен как относительный к контрольному уровню, который произвольно устанавливался как “1,0."(D–F) уровни TNF-α (D), IL-1β (E) и IL-6 (F) в супернатанте культуры измеряли методом ИФА. Результаты показывают среднее значение ± S. E. M., полученное из 4 независимых экспериментов,и были проанализированы с помощью односторонней ANOVA с последующим HSD-тестом Tukey's post hoc. **P < 0.01, существенная разница между скобках значений. J) клетки BV-2 обрабатывали в течение 24 ч 30 мкм DA в отсутствие или присутствии 10 мм NAC. Затем уровень хинопротеина определяли путем проведения анализа NBT/glycinate. Уровень хинопротеина был выражен в виде процентного увеличения по сравнению с таковым в необработанном контроле. Результаты показывают среднее значение ± S. E. M., полученное из 3 независимых экспериментов,и были проанализированы с помощью односторонней ANOVA с последующим HSD-тестом Tukey's post hoc. ** P

Далее мы оценивали образование хинопротеинов после обработки дофамином клеток БВ-2. Обработка клеток 30 мкм дофамином в течение 24 ч повышала уровень хинопротеинов в клетках, и это повышение ингибировалось 10 мм NAC ( Рис.2). 3J).

Предварительная обработка 30 мкм дофамином в течение 1 ч не смогла ослабить индуцированную ЛПС ( 10 мкг/мл) экспрессию мРНК цитокинов (Рис.2). 4 А–С). С другой стороны, в присутствии 300 Ед/мл тирозиназы, катализирующей окисление дофамина до хинона дофамина, предварительная обработка 30 мкм дофамина существенно ослабляла экспрессию ЛПС-индуцированной мРНК этих цитокинов. В присутствии 300 Ед/мл тирозиназы обработка 30 мкм дофамина в течение 1 ч значительно повышала уровень хинопротеина ( Рис.2). 4D), предполагая, что дофамин ослаблял индуцированную ЛПС экспрессию мРНК этих цитокинов через образование хинона дофамина в клетках BV-2.

4. Тирозиназа ускорила ингибирование ЛПС-индуцированной мРНК экспрессии цитокинов дофамином в клетках BV-2 Клетки БВ-2 обрабатывали в течение 1 ч 30 мкм дофамином (да) в отсутствие или присутствии 300 Ед/мл тирозиназы в дмэм без тирозина без сыворотки крови. Затем клетки обрабатывали 10 мкг/мл ЛПС в FBS / DMEM в течение 9 ч. уровни мРНК ФНО-α (А), Ил-1β (Б) и ИЛ-6 (в) исследовали методом РТ-ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК цитокинов были нормализованы к β-актину и экспрессировались как относительные к контрольному уровню, который произвольно устанавливался равным 1,0. Результаты показывают среднее значение ± S. E. M., полученное из 4 независимых экспериментов,и были проанализированы с использованием односторонней ANOVA с последующим HSD-тестом Tukey's post hoc. **P < 0.01, существенная разница между скобках значений. D) клетки BV-2 обрабатывали в течение 1 ч 30 мкм да в отсутствие или присутствии 300 Ед/мл тирозиназы в ДМЭМ без тирозина без сыворотки крови. Затем уровень хинопротеина определяли путем проведения анализа NBT/glycinate. Уровень хинопротеина был выражен в виде процентного увеличения по сравнению с таковым в необработанном контроле. Результаты показывают среднее значение ± S. E. M., полученное из 3 независимых экспериментов,и были проанализированы с использованием односторонней ANOVA с последующим HSD-тестом Tukey's post hoc. ** P