Продолжение
2.10. Иммуноцитохимия
Клетки БВ-2, посеянные на 15-мм покровном стекле, фиксировали 3,7% - ным формальдегидом в течение 15 мин, а затем промывали 3 раза ПБС. Далее клетки подвергали проницаемости 0,1% раствором Тритона-х 100 в ТБС в течение 15 мин при комнатной температуре. После промывания ТБС клетки окрашивали анти–NF-kB p65 поликлональным антителом кролика в ТБС с 0,1% Тритон-х 100 при 4 °С в течение ночи. Затем клетки инкубировали с анти-кроличьим IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 568. Нуклеусы были противопоставлены Hoechst 33342. Coverslips были установлены на стеклянных слайдах с монтажной средой и наблюдались с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (Olympus Fluoview FV1000, Токио, Япония).
2.11. Статистическая оценка
Результаты были выражены в виде среднего ± S. E. M., полученного из 3-х до 4-х независимых экспериментов. Односторонняя ANOVA с последующим тестом tukey's HSD post hoc или двусторонняя ANOVA с последующим тестом Бонферрони post hoc была выполнена с помощью программного обеспечения PASW Statistics 18 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Если значение Р было меньше 0,05, то разница считалась достоверной.
3. Результаты
3.1. Дофамин ослабляет ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов в клетках микроглии мышей BV-2
Во-первых, мы исследовали ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов в клетках BV-2 с помощью РТ-ПЦР в реальном времени. Обработка клеток ЛПС (0,01-10 мкг / мл ) в течение 9 ч повышала уровень мРНК оцениваемых цитокинов (ФНО-α, Ил-1β и ИЛ-6) в зависимости от концентрации ( Рис.2). 1 А–С). Далее мы исследовали влияние предварительной обработки клеток дофамином на экспрессию этой мРНК. Ни допамин (1-30 мкм), ни ЛПС (10 мкг/мл) не проявляли никакой цитотоксичности по отношению к клеткам БВ-2 (см. дополнительную фиг. S1). Лечение дофамином (1-30 мкм) не оказало существенного влияния на уровень мРНК этих цитокинов в клетках БВ-2 (см. дополнительную Рис.2). S2). Однако предварительная обработка клеток дофамином (1-30 мкм) в течение 24 ч значительно ослабляла индуцированную ЛПС (10 мкг/мл) экспрессию мРНК этих цитокинов ( Рис.2). 1 D-F). Кроме того, предварительная обработка с 30 мкм дофамина во времени-зависимо уменьшила их LPS-индуцированную экспрессию мРНК (см. дополнительный фиг. S3), что указывает на то, что дофамин уменьшал индуцированную ЛПС экспрессию мРНК цитокинов в клетках BV-2.
3.2. Дофамин ослабляет ЛПС-индуцированную экспрессию цитокинов через образование хинона дофамина в клетках БВ-2
Ранее нами было показано, что клетки BV-2 экспрессируют мРНК дофаминовых D 2 и D 5 рецепторов, дофаминовых D 1-подобных и D 2-подобных рецепторов соответственно ( Yoshioka et al., 2016). Чтобы определить, ослабляет ли дофамин индуцированную ЛПС экспрессию мРНК цитокинов через дофаминовые рецепторы, мы изучили влияние агонистов дофаминовых рецепторов на уровни экспрессии мРНК цитокинов. Предварительная обработка ни 30 мкм CY 208-243, ни 30 мкм бромокриптином, которые являются агонистами дофаминового D 1-подобного и D 2-подобного рецепторов, соответственно, не повлияли на их экспрессию ( Рис.2). 2С). Кроме того, ни 30 мкм SCH-23390, ни 30 мкм Сульпирид, являясь антагонистами дофаминовых D1-подобных и D2-подобных рецепторов соответственно, не ингибировали ослабление ЛПС-индуцированной экспрессии мРНК цитокинов дофамином на 30 мкм ( Рис.2). 2 А–С). В соответствии с этим результаты ИФА показали, что ЛПС-индуцированное увеличение в эти уровни цитокинов в культуре супернатанта не была затронута 30 мкм ТИЦ 208-243 ни 30 мкм Бромокриптин и что затухание на 30 мкм дофамина ЛПС-индуцированное увеличение в них не тормозится 30 мкм с SCH-23390 и сульпирида 30 мкм (рис. 2D-F). Таким образом, эти результаты указывают на то, что дофаминовые рецепторы не были вовлечены в индуцированное дофамином снижение экспрессии цитокинов в клетках BV-2.
