Продолжение
2. Материалы и методы
2.1. Этика
Эксперименты на животных были одобрены комитетом по этическому использованию экспериментальных животных в Университете Сэцунан (идентификатор утверждения: K12-14) и проводились в соответствии с руководящими принципами японского общества фармакологии И. Все усилия были направлены на то, чтобы свести к минимуму страдания животных и сократить число используемых животных.
2.2. Антитела и химические вещества
Анти–NF-kB p65 кроличьи поликлональные антитела были приобретены у компании Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) и Proteintech Group Inc. (Чикаго, Иллинойс, США). Анти-ингибитор kappa B (IkB)-α кроличье поликлональное антитело было получено из биотехнологии Санта-Крус. ЛПС Escherichia coli (серотип 0111:B4), гидрохлорид дофамина, неселективный антагонист допамин D 1-подобного рецептора (5R) - 8-хлор-3-метил-5-фенил-1,2,4,5-тетрагидро-3-бензазепин-7-ол; гидрохлорид (SCH-23390), неселективный дофамин D 2- подобный антагонист рецепторов Сульпирид, N-ацетил-L-цистеин (NAC), тирозиназа (EC 1.14.18.1), нитросиний тетразолий хлорид (NBT) и гидрат динатриевой соли АТФ были получены из Sigma (St.Louis, MO, USA). Неселективный агонист допамин D 1-подобного рецептора (−)- (6aR,12bR) -4,6,6 a,7,8,12 b-Гексагидро-7-метилиндоло[4,3-a]фенантридин (CY208-243) был куплен у компании Tocris Bioscience (Миссури, Миннесота, США). Ингибитор транслокации NF-kB SN50 был приобретен у компании Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Неселективный допамин D 2- подобный агонист рецептора Бромокриптин, ксантиноксидаза (EC 1.1.3.22) и все другие химические вещества были получены из WAKO Pure Chemical (Osaka, Japan).
2.3. Культура клеток и лечение препаратами
Бессмертная линия мышиных микроглиальных клеток BV-2 сохранялась в модифицированной среде Орла Дульбекко (DMEM), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой ( FBS/DMEM), как описано ранее (Yoshioka et al., 2010). Клетки осаждали при плотности 1 × 10 5 /лунка в 24-луночных культуральных пластинках ткани для иммуноцитохимического и люциферазного анализов или при плотности 6 × 10 5 / лунка в 60-миллиметровых чашках для всех других экспериментов.
Первичные культуры мышиной микроглии были получены от послеродовых дней 0-2 C57BL / 6N мышей, как описано ранее ( Yoshioka et al., 2016). Вкратце головной мозг измельчали и обрабатывали 0,25% раствором трипсина-ЭДТА (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) при 37 °C в течение 5 мин с перемешиванием каждые несколько минут. Механически диссоциированные клетки фильтровали через 100-мкм клеточный фильтр (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) и помещали в колбы размером 75 см2 в FBS/DMEM, дополненные 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и 1 мкг/мл Фунгизона. Клетки выдерживали при 37 °С 5% СО2, Атмосфера воздуха 95%. Последующая замена среды проводилась каждые 3-4 дня. Через 14-20 дней культивирования плавающие клетки и клетки, слабо прикрепленные к смешанному первичному культуральному слою, выделяли механическим перемешиванием на орбитальном шейкере (200 об / мин) в течение 1 ч при 37 °C. полученную клеточную суспензию переносили в чашку Петри (BD Falcon) и оставляли адгезироваться при 37 °C. незакрепленные клетки удаляли через 30 мин, а микроглии выделяли как сильно прилипшие клетки. Чистота культур микроглии была подтверждена иммуностейнированием для Iba1, маркера микроглии; и эти культуры были > 95% чистыми. Микроглиальные клетки были покрыты в FBS /DMEM при 3 × 10 5 / тарелке в тарелках диаметром 35 мм для анализа в режиме реального времени RT-PCR и Western blot.
Клетки инкубировали в течение 24 ч в свежей питательной среде, содержащей 1-100 мкм дофамина. Затем культуральную среду аспирировали и заменяли свежей средой, содержащей ЛПС (1 нг/мл-10 мкг/мл). Эксперименты с использованием тирозиназы были проведены в DMEM без фенол-красного и тирозина (тирозин-свободный DMEM). Все остальные эксперименты проводились с использованием FBS / DMEM. CY208-243, bromocriptine, и surpiride были растворены в чисто диметилсульфоксиде и разбавлены в FBS/DMEM до пользы. SCH-23390, Сульпирид и NAC были добавлены за 1 ч до воздействия дофамина. SN50 добавляли за 1 ч до воздействия ЛПС.
