2. Материал и способы
2.1. Животные
Животные были обработаны в соответствии с национальными и институциональными руководящими принципами для исследований на животных и экспериментальной работы, одобренной датским экспериментом на животных Expectatory (лицензия № 2016-15-0201-00948 и 2016-15-0201-00982). Самцы крыс линии Wistar (Janvier, Франция) были использованы в возрасте 7-8 недель в исследовании AMI, а также в возрасте 11-12 недель как в телеметрическом, так и в миографическом исследовании. Крысы содержались в животноводческом помещении в клетках (универсальных евро III типа длиной) со стандартной деревянной подстилкой, получали стандартный рацион питания и имели доступ к воде ad libitum, а также содержались в условиях температурного и влажностного контроля с 12 ч/12 ч светлого/темного циклов соответственно.
2.2. Материалы
Изопреналина гидрохлорид, фенилэфрин гидрохлорид, U4661 (9[(5З)-7-[(1Р,4С,5С,6р)-6-[(1Е,3С)-3 - Окси-1-октенил]-2-oxabicyclo[2.2.1]Нерт-5-Ил]-5-heptenoic кислота]), празозин гидрохлорид, йохимбин, XE991 [10,10-бис(4-pyridinylmethyl)-9(10ч)-anthracenone], Эванс синий 1%, 2,3,5-Triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) 1%, формальдегид 4% забуференном, dimethylsulphoxide (ДМСО) ≥ 99%, Dulbecco в фосфатно-солевой буфер, (D8537) (все из Сигма-Алдрич, Сент-Луис, США).
2.3. Телеметрические измерения среднего артериального давления (МАП) и частоты сердечных сокращений
Для изучения гемодинамических изменений после введения ХЕ991 в сознании крыс мы непрерывно измеряли артериальное давление и частоту сердечных сокращений с помощью радиотелеметрии, как описано ранее ( Laursen et al., 2017). Крысам проводили анестезию комбинацией кетамина (3 мг/кг; Кетаминол®vet, Intervet International, an Boxmeer, Нидерланды) и ксилазина (0,75 мг / кг; Наркоксил®vet, Intervet International, AN Boxmeer, Нидерланды), а также имплантировали телеметрический преобразователь (TA11PA-C40; Data Sciences International, ST. Paul, MN, USA). Брюшная кожа обезболиваемой крысы была выбрита и стерилизована,а средний разрез был сделан через кожу и брюшную стенку. Окружающие кишки были втянуты смоченной физиологическим раствором марлей для доступа к брюшной аорте. Аорта была отделена от кавальной вены, и кусок 4-0 шва был помещен ниже, чтобы временно перекрыть кровоток. С помощью изогнутой шприцевой иглы 22-го калибра катетер телеметрического преобразователя был выдвинут в аорту. Небольшое количество тканевого клея (3M Vetbond, 3M Animal Care Product, St.Paul, MN, USA) было применено для закрепления катетера на месте с небольшим волоконным пластырем. Окклюзия аорты и ретракция марлевой губки были удалены. Передатчик помещался в верхней части кишечника. Брюшная стенка и кожа были закрыты 4-0 швами, и была введена анальгезия (подкожно 0,2 мг/кг; Temgesic, Reckitt Benckiser Healthcare Limited, Hull, UK).
Крысам было разрешено восстанавливаться в течение по крайней мере одной недели до начала экспериментального протокола. Сигналы были записаны непрерывно в течение 2 ч, перед последующим введения трех доз XE991 (0,075 мг/кг 0,75 мг/кг и 7,5 мг/кг, внутрибрюшинно) с интервалом 2 сек между каждым введением, что позволяет клиренс более 90% XE991 между каждой дозы предполагая, что период полураспада 0,6 ч, а на конструктивно подобные составные linopirdine (Rakestraw и соавт., 1994). После каждой внутрибрюшинной инъекции крысам давали отдохнуть 10 мин до начала измерения, чтобы избежать стресса, влияющего на результаты. Кроме того, мы сравнили активный препарат с транспортными инъекционными животными для изучения эффекта с XE991 в качестве единственной переменной. Регистрация и анализ проводились с помощью программного обеспечения Dataquest A. R. T software 4.3 (Data Sciences International, St.Paul, MN, USA).
2.4. Миограф эксперименты
Крысы были убиты ударом по голове с последующим обескровливанием. Брыжеечное ложе удаляли, и его немедленно помещали в холодный физиологический раствор (4 °с) следующего состава (мм): NaCl 119, KCl 4,7, KH 2 PO 4 1,18, MgSO 4 1,17, NaHCO 3 25, CaCl 2 1,6, EDTA 0,026 и глюкоза 5,5. Для выяснения влияния XE991 на сосудистый тонус в резистентных артериях сегменты мелких брыжеечных артерий крыс выделяли и устанавливали на микрососудистые миограммы (датская Myotechnology, Орхус, Дания) для записи изометрического напряжения, как описано ранее ( Bangshaab et al., 2019). Сосуды уравновешивали в оксигенированном (5% СО2 на воздухе) физиологическом растворе соли (рН 7,4), нагретом до 37 °C. Для определения диаметра просвета, который артерия имела бы in vivo при расслабленном состоянии и при трансмуральном давлении 100 мм рт.ст., сосуды растягивали по стандартной методике. Артерии были установлены на 90% от этого диаметра, что является оптимальной окружностью сосуда для максимального развития силы ( Mulvany and Halpern, 1977). Для проверки жизнеспособности тканей артериальные сегменты подвергали воздействию изотонического физиологического раствора, содержащего высокую концентрацию калия (123 мм) или норадреналина (10-5 м), что приводило к максимальному сужению сосудов. Для проверки функции эндотелия сосуды сокращали с помощью фенилэфрина или норадреналина, а затем стимулировали ацетилхолином (10 мкм). Чтобы проверить, вызвано ли сокращение XE991, кумулятивные кривые концентрации-отклика для XE991 были выполнены при напряжении покоя или в сосудах, сокращенных до 20% от максимального отклика добавлением 10 -6 М фенилэфрин. Для изучения ингибированной релаксации ХЭ991 были получены кривые концентрации-ответа для агониста β-адренорецепторов изопреналина в артериях, сокращенных аналогом тромбоксана U46619 (10 -7 м), в отсутствие и присутствии ХЭ991 (10 -5 м). Во избежание вклада α-адренорецепторов в изопреналиновые реакции кривые проводили в присутствии празозина (10 -6 м) и йохимбина (10 -6 м).
2.5. Электрокардиографические (ЭКГ) измерения
K v 7 каналов экспрессируются в проводящей системе и мышечных волокнах сердца (Testai et al., 2016; Hedegaard et al., 2016; Sanguinetti et al., 1996). Поэтому у обезболиваемых животных мы исследовали влияние ХЕ991 по сравнению с транспортным средством на электрическую активность сердца. Крыс анестезировали смесью s-кетамина гидрохлорида (60 мг/кг; Pfizer, Ballerup Denmark) и ксилазина (10 мг / кг; Rompun vet, KVP Pharma + Veterinär produkte Bayer, Kiel Germany) внутрибрюшинно. ЭКГ регистрировалась в течение не менее 30 мин для обеспечения нормального ритма; после этого в двух подгруппах животных вводили увеличенные дозы vehicle или XE991 с интервалом 30 мин. Данные были получены с помощью животного био-усилителя (AD Instruments Oxford, Великобритания), и программное обеспечение автоматически получало различные значения ЭКГ, как описано ранее ( Comerma-Steffensen et al., 2017)., Сигналы ЭКГ были низко-пропускают фильтрованный путем использование стандартного фильтра для крыс. Скорректированный по скорости интервал QT (QTc) был рассчитан с использованием стандартной формулы Базетта (QT C = QT/√RR).