2. Материалы и методы
Образцы крови были получены от здоровых доноров во Французском институте банка крови (Etablissement Français du Sang, EFS) после получения письменного информированного согласия, в соответствии с соглашением между EFS и Парижским университетом Декарта (конвенция ref. C CPSL UNT n°12 / EFS / 038). Пробы крови отбирали в 0,105 м натриевых лимоннокислых пробирках (BD Vacutainer, Franklin Lakes, New Jersey, USA) или в кислых лимоннокислых пробирках (ACD) (BD Vacutainer, лимонная кислота 5,7 мм, тринатриевый цитрат 11,2 мм и декстроза 20 мм, конечные концентрации) для приготовления промытой суспензии тромбоцитов.
2.1. Выделение и приготовление промытой суспензии тромбоцитов
Образцы крови, собранные в пробирки ACD, смешивали с промывным буфером (лимонная кислота 36 мм, глюкоза 5 мм, KCl 5 мм, CaCl 2 2 мм, MgCl 2 1 мм и NaCl 103 мм; рН=6,5), содержащий 0,2 мкм простагландина Е1 (PGE1, Sigma Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) и 0,03 МЕ/мл апиразы (Agro-Bio, La Ferté-Saint-Aubin, France) для предотвращения активации тромбоцитов во время приготовления. Богатую тромбоцитами плазму получали после первого отжима (216 г в течение 11 мин при комнатной температуре). Тромбоциты дважды промывали промывным буфером, содержащим PGE1 и апиразу, и центрифугировали (1200 г в течение 11 мин). Последняя таблетка ресуспендировалась в суспензионном буфере (Hepes 10 мм, NaCl 140 мм, KCl 3 мм, NaHCO 3 5 мм, MgCl 2 0,5 мм, а глюкозы 10 мм; рН=7,35)до конечной концентрации 3 × 10 8 тромбоцитов/мл. Для предотвращения десенсибилизации рецепторов АДФ добавляли апиразу (0,03 МЕ/мл), затем добавляли CaCl 2 2 мм ( Ardlie et al., 1971).
2.2. Агонисты и ингибиторы
Тикагрелор был извлечен из таблеток (Brilique® 90 мг, AstraZeneca). Вкратце таблетки диспергировали в 10 мм HCl и водорастворимый эксципиент экстрагировали центрифугированием (5 мин, 5000 г, 20 °с). Гранулы промывали 3 раза дистиллированной водой с последующим центрифугированием (5 мин, 5000 г, 20 °с). Гранулы ресуспендировали в дистиллированной воде, замораживали в жидком азоте, затем лиофилизировали. Тикагрелор извлекали из лиофилизированного материала путем инкубации в чистом ДМСО. Нерастворимый материал в насыщенном тикагрелором ДМСО удаляли двумя центрифугированием (5 мин, 5000 г, 20 °с). Концентрация насыщенного тикагрелором раствора ДМСО составляла около 100 мг / мл и разбавлялась на 1/10 в чистом ДМСО перед хранением при -80 °С. дальнейшие разбавления проводили в суспензионном буфере, содержащем 1% ДМСО. Конечная концентрация ДМСО во всех опытах составила 0,001%. Конечная концентрация тикагрелора оценивалась по ссылке на сырье тикагрелора, предоставленное компанией AstraZeneca (Мельндаль, Швеция).2 АДФ (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France), разведенный в суспензионном буфере, использовали в конечной концентрации 10 мкм. В качестве основного агониста использовали активируемый протеиназой рецептор-1-активирующий пептид (PAR-1-AP, Bachem, Basel, Switzerland) в конечной концентрации 2 мкм для оценки АДФ, высвобождаемого из плотных гранул после активации тромбоцитов, или в конечной концентрации 10 мкм для обеспечения максимальной активации. Специфический P2Y 1 ингибитор MRS2179 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) разводили в 0,9% физиологическом растворе и использовали в конечной концентрации 10 мкм. Неселективный ингибитор PI3K вортманнин (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) разбавляли в суспензионном буфере, содержащем 0,2% диметилсульфоксида (ДМСО), и использовали в конечной концентрации 0,5 мкм. Отмытые тромбоциты инкубировали с тикагрелором в течение 10 мин при 37 °С до начала применения. Конечная концентрация 150 Нм тикагрелора была выбрана, поскольку он ингибировал по меньшей мере 80% агрегации тромбоцитов, согласно исследованию с ранжированием доз ( Рис.2). S1). В экспериментах с цельной кровью конечная концентрация 3,25 мкм тикагрелора использовалась для получения по меньшей мере 80% ингибирования агрегации тромбоцитов, как это было описано ранее.2 эпинефрин (EPI, Aguettant, Lyon Gerland, France) разбавляли в суспензионном буфере и использовали в конечной концентрации 10 мкм, выбранной после исследования диапазона доз как наименьшая концентрация, повышающая АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов до аналогичного уровня, чем 10 мкм PAR-1-AP.