Продолжение 3
2.7. Вариабельность сердечного ритма
Вариабельность сердечного ритма - это неинвазивная мера вегетативной функции, которая отражает вариабельность ритма сердца от удара к удару. Для анализа вариабельности сердечного ритма использовались записи артериального давления от обезболиваемых крыс, полученные в ходе оценки почечной гемодинамики. Анализы проводились с использованием программного обеспечения LabChart (версия 8.1.11, RRID: SCR_001620, ADInstruments). В программном комплексе была выбрана опция для крыс и рассмотрены точки в интервале 100-200 МС. Эктопические удары и артефакты были удалены вручную. В спектральном анализе рассматривалось в среднем 1500 точек за 5 мин записи. При измерении вариабельности сердечного ритма были получены несколько временных и частотных параметров. Во временной области были рассмотрены следующие параметры: стандартное отклонение частоты сердечных сокращений (SD HR), представляющее собой среднее значение стандартных отклонений частоты сердечных сокращений, и pRR50, представляющее собой процент r-r интервалов с вариациями >50 мс. В частотной области были проанализированы следующие диапазоны: очень низкая частота (VLF, 0-0, 2 Гц), низкая частота (LF, 0,2–0,75 Гц) и высокая частота (HF, 0,75–2,5 Гц) (Malik et al., 1996). Для анализа вариабельности сердечного ритма были взяты три 5-минутных периода: исходный, 30 мин и 65 мин после начала инфузии транспортного средства или NPCdc.
2.8. Активность Na + - насоса в обогащенной мембраной фракции проксимальных канальцев
Кортицис коры головного мозга, который является внешним слоем коры головного мозга, был удален из почек с помощью микротома (модель Stadie-Riggs). Ткань быстро замораживали в жидкости N 2 и затем хранили при температуре -80 °С до проведения последующих экспериментов. Мембранно-обогащенные фракции были получены так, как описано ранее ( Vieyra et al., 1986). Этот метод обеспечивает получение в среднем 90% мембран из проксимальных канальцев ( Vieyra et al., 1986). Один миллиграмм коркового вещества коры головного мозга гомогенизировали в 4 мл изосмотического буфера (250 мм сахарозы, ГЕПЕС-Трис, 2 мм ЭДТА и 0,15 мг мл -1 ингибитор трипсина и PMSF 1 мм, рН 7,4) в трубке измельчителя ткани, погруженной в ледяную ванну с использованием тефлонового пестика (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA), соединенного с верхней мешалкой (IKA®RW20, Staufen, Germany), работающей при 1200 об / мин в течение 2 мин. Гомогенат центрифугировали в Роторе JA-20 при 755 × g в течение 15 мин при 4 °C (Beckman Coulter, Avanti J-E centrifuge, Indianapolis, IN, USA). Полученный супернатант центрифугировали при 8500 × g в течение 20 мин при 4 °C с использованием той же центрифуги. Наконец, была выполнена еще одна стадия центрифугирования (центрифуга Beckman Optima, LE-80k ultra) при 35 000 × g в течение 45 мин при 4 °C с использованием Ротора 70 Ti. Гранулу ресуспендировали в 250 мм сахарозе, рН 7,4, аликвотировали в пробирки и хранили при -20 °С.
Активность Na + - насоса в базолатеральных мембранах проксимальных канальцев оценивали путем измерения количества неорганического фосфата ( Pi), выделяемого из АТФ, как описано в другом месте (Ribeiro et al., 2018). Аликвоты 0,05 мг белка в мл (в трипликатах) предварительно инкубировали с 50 мм бис-Трис-пропаном (рН 7,4), 0,2 мм ЭДТА, 5 мм Mgcl2 и 120 мм NaCl в отсутствие или присутствии 2 мм уабаина в течение 10 мин при 37 °С для оценки активности Na + /K +- АТФазы. Реакцию (конечный объем 0,2 мл) начинали с добавления смеси АТФ и KCl (5 и 24 мм соответственно, конечные концентрации) и останавливали через 10 мин с добавлением 0,5 мл 0,1 м HCl-активированного угля.
Активность второго Na + - насоса в базолатеральных мембранах проксимальных канальцев, Na + - АТФазы, оценивали с помощью ранее описанных методов ( Ribeiro et al., 2018). Этот энзим ouabain-нечувствителен и фуросемид-чувствителен. Аликвоты 0,2 мг белка / мл (в трехкратной повторности) инкубировали с 20 мм HEPES-Трис (рН 7,0), 10 мм MgCl2, 120 мм NaCl, 5 мм АТФ и 2 мм уабаина в отсутствии или присутствии 2 мм фуросемид при 37 °С. Количество Пи от двух насосов был спектрофотометрически измеряли путем определения оптической плотности при 620 Нм.
2.9. O 2 • - уровни и активность НАДФН-оксидазы
Уровень O2 • - в грудных сегментах аорты и почке оценивали с помощью метода хемилюминесценции, усиленной люцигеном ( Ribeiro et al., 2018). Для получения гомогенатов грудной аорты 10 мм сегмент аорты гомогенизировали в 300 мкл буфера RIPA (50 мм Tris, 150 мм NaCl, 1 мм EDTA, 1% triton X-100, 1% deoxycholate, 0,1% SDS и 1 мм PMSF), дополненного коктейлем ингибиторов протеаз (2 мм AEBSF, 1 мм EDTA, 130 мкм bestatin, 14 мкм E−64, 1 мкм leupeptin и 0,3 мкм aprotinin) с использованием трубки для измельчения ткани со стаканом пестик (starglass, 5 мл) на ледяной бане для получения гомогенатов грудной аорты. Гомогенаты грудной аорты центрифугировали при 15000 × g в течение 15 мин при 4 °C. Гомогенаты почек центрифугировали при 12000 × g в течение 12 мин при 4 °C. супернатант добавляли к фосфатно-буферному физиологическому раствору (рН 7,4) в соотношении 0,1 мл:1 мл в присутствии и отсутствии 100 мкм NADPH. Хемилюминесценцию измеряли на люминометре (Varioskan Flash, Thermo Scientific, Vantaa, Финляндия) с интервалом 30 С в течение 5 мин при 37 °С до и после добавления 10 мкм люцигенина. Для уменьшения смещения люцигенинового окислительно-восстановительного цикла в присутствии эндогенных клеточных редуктаз ( Лиочев и Фридович, 1997), анализ данных рассматривал люцигенин-продуцированную хемилюминесценцию в присутствии и отсутствии образца. Анализы проводились в трех экземплярах. Хемилюминесценция люцигенина сообщается как относительные световые единицы в минуту на миллиграмм общего белка (rlu / mg белка).