Продолжение 1
2. Материал и способы
2.1. Этическое одобрение
Все процедуры с использованием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами бразильского общества лабораторных наук о животных (SBCAL) и прошли этический обзор и были одобрены комитетом по экспериментальной и животной этике в федеральном университете Пернамбуку (протокол зарегистрирован под № 23076.016262/2015-01). Эти руководящие принципы строго соответствуют тем, которые содержатся в руководстве национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH № 8023, пересмотренный 1978 год).
2.2. Химические вещества и наркотики
Кетамин и ксилазин были получены из CEVA (Paulínia, SP, Бразилия), а гепарин был получен из Blau Farmacêutica S/A (Cotia, SP, Бразилия). Колориметрические наборы мочевины и креатинина энзима assay были получены от Labtest (Lagoa Santa, MG, Бразилия). N,N'-диметил-9,9'-биакридинийд динитрат (люцигенин), β-никотинамидадениндинуклеотид 2'-фосфат восстановленный гидрат тетразодной соли (НАДФН), Фолин-Циокалтеу фенольный реагент, бис-Трис-пропан, тризма, бычий сывороточный альбумин (БСА), коктейль ингибиторов протеаз, Тритон х-100, дезоксихолат, АТФ, ингибитор трипсина, фенилметилсульфонилфторид (pmsf), aebsf, ouabain, фуросемид, инулин, Антон, реагент Грисса и ЭДТА были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США). Реактив Брэдфорда был получен из био-рад (Hercules, CA, USA). Тиопентал был получен из Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos (Сан-Паулу, SP, Бразилия). Нитроцеллюлозные мембраны были приобретены у компании GE Healthcare (Букингемшир, Великобритания). Моноклональные антитела против ERK1/2 (кошки# 13-6200, RRID: AB_2533024), Р-ERK1/2тр−202/тир−204 (кошка# МА5-15174, RRID: AB_10980347), акт (кошки# МА5-14898, RRID: AB_10983391), п-актСер−473 (кошки# OMA1-03061, RRID: AB_557533), β-актина (кошки# МА5-15739, RRID: AB_10979409) и козьи анти-мышиные IgG (с Кот# 62-6520, RRID: AB_2533947) были приобретены у Термо Фишер научных (Уолтем, Массачусетс, США). Анти-козий IgG (Cat# ab6741, RRID: AB_955424), анти-p-iNOS Tyr−151 (Cat# ab182640, RRID: AB_10697752 ) и человеческие P-nNOS Ser−1417 (Cat# ab5583, RRID: AB_304964) антитела были приобретены у компании Abcam (Кембридж, Великобритания). Антитела cGKIa / β (Cat# sc-271766, RRID: AB_10709434 ) и p-NOS3 Ser−1177 (Cat# sc-12972, RRID: AB_653178 ) были получены из компании Santa Cruz Biotechnology (Даллас, Техас, США). Иммобилон Форте Западный субстрат HRP и анти -- eNOS / NOS3 (Cat# 07-520, RRID: AB_310684 ), анти -- nNOS / NOS I (Cat# 07-571, RRID: AB_310722), и IgG анти -- кролика козочки (Cat# AP307P, RRID: AB_92641) антитела были приобретены у компании Merck Millipore (Burlington, MA, USA).
2.3. NPCdc
NPCdc был синтезирован GenOne (Рио-де-Жанейро, RJ, Бразилия). Молекулярная масса NPCdc составляет 3,453 КДА, а его аминокислотная последовательность-VSTSRGSQGCFGLKLDRIGAASGLGCWRRIVDS.
2.4. Животные и процедуры, используемые для 5/6 нефрэктомии
Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 120 суток и массой 300-350 г. животные содержались в индивидуальных клетках в помещении с контролируемой температурой 23 °С по 12-часовому светлому/темному циклу, со свободным доступом к воде и пище. Животные были рандомизированы и подверглись фиктивной операции (sham; n = 29) или 5/6 нефрэктомии (5/6Nx; n = 31). Хирургические процедуры, фиктивная хирургия и 5/6 нефрэктомия были выполнены у животных, которые были анестезированы смесью кетамина (80 мг / кг, i.p.) и ксилазина (10 мг/кг, i.p.) на теплом столе для поддержания ректальной температуры 36,5 °C. После лапаротомии два из трех разветвлений левой почечной артерии были инфарктированы, что привело к уменьшению массы левой почки на ~1/3. Правая почечная артерия и Вена были инфарктированы, а правая почка удалена ( Griffin et al., 1994; Paixão et al., 1998). Для фиктивной операции была рассечена левая почечная артерия, но не инфаркт. Во время хирургических вмешательств в брюшную полость постоянно добавляли физиологический раствор физраствора. После восстановления после наркоза крыс содержали в отдельных клетках.