2. Материалы и методы
2.1. Этическое одобрение
Это исследование было одобрено Советом по этике медицинских наук и научных исследований Университета Оттавы и соответствовало стандартам, установленным Хельсинкской декларацией. Устное и письменное информированное согласие было получено от всех добровольцев до начала участия в исследовании.
2.2. Участники:
Двадцать один физически активный здоровый молодой человек участвовал в одной из двух экспериментальных фаз, из которых 5 участвовали в обеих (минимум 7 дней между экспериментальными испытаниями). Масса тела, рост и возраст участников, представленные в виде средних ± SD, были следующими: 77,6 ± 13,9 кг, 1,73 ± 0,05 м и 28 ± 5 лет в эксперименте. Основываясь на наших предыдущих данных ( Fujii et al., 2017 ), минимальный размер выборки n = 10 для кожной сосудистой проводимости был определен с мощностью 80% и Альфа-набором до 0,05.
Никто из участников не курил сигареты и не принимал рецептурные лекарства. Кроме того, ни один из них не имел в анамнезе мутаций трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза, кожных заболеваний, гипертонии, болезней сердца, диабета или вегетативных расстройств. В настоящем исследовании оценивались только мужчины, поскольку существуют отчетливые половые различия в регуляции местных кожно-сосудистых реакций (Fujii et al., 2015; Greaney et al., 2014).
2.3. Экспериментальное проектирование
Протоколы экспериментов 1 и 2 были идентичны, за исключением используемых препаратов (см. ниже). В обоих экспериментах все участники прибыли в лабораторию, воздержавшись от приема безрецептурных лекарственных препаратов, включая нестероидные противовоспалительные средства, витамины и минералы в течение не менее 48 ч, напряженной физической нагрузки накануне вечером, потребления алкоголя и кофеина не менее 12 ч до начала исследования и любой пищи за 2 ч до начала исследования. Участники первоначально сидели на полулежачей кровати, в которой температура в помещении была установлена на термонейтральную температуру ~24 ° C. В течение этого времени четыре внутрикожных микродиализных волокна (срез 30 КДА, мембрана 10 мм) (MD 2000, Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN, USA) асептически помещали в кожный слой на дорсальной стороне левого предплечья. Для размещения волокна, игла 25-го калибра первоначально была введена в неанестетизированную кожу, а затем микродиализное волокно было продето через просвет иглы. После этого иглу удалили, оставив на месте только волокно. Точки входа и выхода каждого микродиализного волокна были разделены на ~2,5 см. Во избежание перекрестного загрязнения, вызванного диффузией фармакологических агентов между участками, волокна микродиализа были разделены по меньшей мере на 4,0 см. Примерно через 10 мин после завершения введения волокна было начато введение фармакологического агента, которое продолжалось до завершения теста веноартериолярного рефлекса (Подробнее см. ниже).
2.4. Препараты для эксперимента 1-роли NOS и COX
Эксперимент 1 был использован для оценки того, участвуют ли NOS и COX в веноартериолярном рефлексе. Четыре микродиализ волокон непрерывно заливали в случайном порядке с: 1) лактированного раствора Рингера (контроль, Бакстер, Дирфилд, Иллинойс, США), 2) 10 мм Nг-нитро-Л-аргинина (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, Миссури, США), неселективный ингибитор нос, 3) 10 мм Кеторолак, неселективный ингибитор ЦОГ (Сигма-Алдрич), или 4) двойное ингибирование NOS и кокс. Концентрация N G-нитро-L-аргинина ( Medow et al., 2007 ) и Кеторолак (Holowatz et al., 2005; Kellogg et al., 2005) были определены из предыдущих исследований. Все четыре участка были непрерывно перфузированы со скоростью 4,0 мкл / мин с помощью микроинфузионного насоса (модель 4004, CMA Microdialysis, Solna, Швеция) на протяжении всего эксперимента за исключением того, что 50 мм нитропруссида натрия (Sigma-Aldrich) вводили на заключительных этапах для индуцирования максимальной вазодилатации кожи (см. ниже). Все растворы перфузировали в течение не менее 75 мин до начала проведения теста веноартериолярного рефлекса для обеспечения установления каждой блокады ( Holowatz et al., 2005). Этот период также достаточен для того, чтобы преходящая кожная гиперемия, связанная с размещением волокон, спала ( Anderson et al., 1994).