2. Материал и методы.
2.1. Животные и условия эксперимента
Эксперимент проводился в разгар летнего сезона в кампусе факультета зоотехнии и пищевой инженерии Университета Сан-Паулу, Пирасунунга, Бразилия. Использовали двенадцать небеременных средиземноморских буйволов в возрасте 18 месяцев со средней массой тела 380 кг. Все буйволы принадлежали к одному стаду и были полностью приспособлены к условиям тропического лета.Исследование проводилось в климатической камере площадью 45 м 2 , позволяющей одновременно содержать 6 животных. Контроль температуры воздуха осуществлялся путем нагревания или охлаждения воздушного потока, поступающего в климатическую камеру через несколько отверстий, расположенных на высоте 2,1 м вместе с его продольной осью. Параметры окружающей среды внутри камеры устанавливались через центральный пульт управления, расположенный снаружи климатической камеры. Система контроля температуры и влажности реагировала с разумной скоростью и точностью на вызванные тепловые изменения и показала изначально низкую тепловую инерцию.Из-за ограниченного пространства климатической камеры эксперимент проводился в две разные фазы с шестью буйволами в каждой.Все буйволы были подвергнуты обработке, повешены и обучены в течение полутора месяцев до эксперимента с целью снижения реактивности и лучшей адаптации к новым условиям обращения и окружающей среды. Перед началом эксперимента буйволы ненадолго отправились в климатическую камеру, чтобы привыкнуть к шуму, запаху и пространству. Только когда наблюдалась полная десенсибилизация буйвола к окружающей среде камеры и процедурам обработки, начинался период адаптации с размещением животных на их последних местах. В начале эксперимента все буйволы были очень спокойными и плохо реагировали на людей и процедуры обработки. Буйволов содержали в отдельных стойлах (2,5 × 1,4 м) и ограничивали поводом для головы. Диета состояла из концентрата и кукурузного силоса (пропорция 20/80 в пересчете на сухое вещество) с 76% общего количества перевариваемых питательных веществ (TDN) и 18% сырого белка (CP). Пища, вода и минеральная смесь были доступны по желанию, свежая еда предоставлялась два раза в день (0600 ч и 1600 ч). Буйволов содержали в отдельных стойлах (2,5 × 1,4 м) и ограничивали поводом для головы. Диета состояла из концентрата и кукурузного силоса (пропорция 20/80 на сухое вещество) с 76% TDN и 18% CP.
2.2. Экспериментальная дизайн
Каждое испытание длилось 12 дней. Был установлен двухдневный период адаптации для адаптации или привыкания буйволов к различным процедурам, с которыми они столкнутся во время теста, и десять дней для сбора данных. Данные были получены в два периода для лучшего понимания реакции животных на тепловые волны. Значения периода 1 служат базовой линией для каждого буйвола и представляют собой отдельное сравнение для смоделированных реакций на тепловую волну. В течение периода 1 (P1) условия окружающей среды должны были быть такими же, как те, которые наблюдаются за пределами климатической камеры, т. Е. Такие, которые естественным образом встречаются в тропическом климате летом; тогда как Период 2 (P2) был установлен на смоделированную волну тепла. Условия климатической камеры устанавливались следующим образом: (P1) 4 дня, с суточным циклом температуры воздуха (Ta) и относительной влажности (RH) с Ta и RH при 27 ± 1 ° C и 76% с 06:00 до 19:00, для руки 24 ± 1 ° C и 80% с 1900 до 06:00; (P2) 4 дня, имитирующие ежедневный цикл температур тепловой волны, с Ta и RH, поддерживаемыми при 35 ± 1 ° C и 76% с 06:00 до 19:00 и 27 ± 1 ° C и 80% с 1900 по 06:00. Два регистраторы данных использовались для измерения температуры воздуха и относительной влажности в оба периода (HOBO U12 Temp / RH / Light / External Data Logger, Onset Computer Corporation, Борн, Массачусетс, США). Регистраторы данных были размещены в двух местах на высоте около 2 м над полом. Индексы температуры и влажности (THI) [ с Ta и RH, поддерживаемыми при 35 ± 1 ° C и 76% с 06:00 до 19:00 и 27 ± 1 ° C и 80% с 19:00 до 06:00. Два регистратора данных использовались для измерения температуры воздуха и относительной влажности в оба периода ( Регистратор температуры HOBO U12 / RH / Light / External, Onset Computer Corporation, Борн, Массачусетс, США). Регистраторы данных были размещены в двух местах на высоте около 2 м над полом. Индексы температуры и влажности (THI) [ с Ta и RH, поддерживаемыми при 35 ± 1 ° C и 76% с 06:00 до 19:00 и 27 ± 1 ° C и 80% с 19:00 до 06:00. Два регистратора данных использовались для измерения температуры воздуха и относительной влажности в оба периода ( Регистратор температуры HOBO U12 / RH / Light / External, Onset Computer Corporation, Борн, Массачусетс, США). Регистраторы данных были размещены в двух местах на высоте около 2 м над полом. Индексы температуры и влажности (THI) [31 ] были рассчитаны следующим образом:TЧАСя= { 1 , 8 . Ta - [ 1 - r H100] × ( Tа - 14 , 3 ) +32}(1)На пятый день каждого периода образцы крови были собраны в 14 ч. 00 м., И никаких других измерений в этот день не проводилось. Образцы крови были собраны в одном и том же порядке в оба периода.
2,3. Физиологические переменные
Переменные, связанные с термостабильностью и ощутимой и испаряющейся потерей тепла, собирали в течение первых 4 дней каждого периода для оценки реакции животных на смоделированную волну тепла, а именно: частоту дыхания (RF), измеренную путем наблюдения за реберными движениями в течение 60 S; ректальная температура (RT), полученная с помощью клинического цифрового термометра (Digitron, с 8-см гибким датчиком); температуры внутреннего основания хвоста (ТТ) и средней толщины тела (КТ), измеренные в пяти разных местах вдоль продольной оси туловища. Оба были измерены с помощью инфракрасного термометра Minolta Land Cyclops. Все эти измерения проводились каждый день в 7 ч, 1000 ч, 13 ч, 1600 ч, 19 ч и 22 ч.Скорость потоотделения измеряли ежедневно в 14:00 с помощью калиброванного цифрового датчика влажности Vapometer TM (Delfin Technologies Ltd., Куопио, Финляндия), который определяет трансэпидермальную потерю воды. В Vapometer используется замкнутый системный подход, свободный от потока окружающего воздуха, для измерения относительной влажности и температуры окружающей среды. Затем устройство удерживается на коже в течение 10–20 с, пока звуковой сигнал не идентифицирует конец измерения; значение скорости потоотделения отображается на дисплее в г / м 2 / ч (точность = ± 10%). Все устройства были предварительно откалиброваны.Накопление тепла (HS) и накопление тепла (CHS) рассчитывали по методике, описанной в [ 32 ]∆RT = (3600 × HS × A) / (Bw × cb)(2)где ΔRT - разница между ректальными температурами в разные часы; HS - накопление тепла [Вт / м 2 ]; А - поверхность животного [м 2 ], где А = 0,13. Bw 0,556 (Bw - масса тела в кг) и cb - удельная теплоемкость животного (3,4 кДж / кг / ° К).CHS = ∑227ЧАСS(3)где CHS - накопленный запас тепла (Вт / м 2 / ч); рассчитывается CHS - сумма накопленного тепла HS в разные промежутки времени (с 07:00 до 22:00), считая нулевым значением в 07:00.
2,4. Параметры крови
Два образца крови были взяты на пятые сутки P1 и P2 в 14:00 из яремной вены. Одну аликвоту крови собирали в сывороточный гель Sarstedt Monovet для определения натрия (Na + ) и калия (K + ). Образцы крови анализировали с использованием диагностического автоматического анализатора электролита AVL 9180, Roche Diagnostics 03157334001 ™ с двухточечной калибровкой, выполняемой каждые четыре часа, и одноточечной калибровкой с каждым тестом, обеспечивающей точность и соответствие.Для количественного определения компонентов эритрограммы образцы крови собирали в вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Количество эритроцитов (Er) измеряли с использованием модифицированного гемоцитометра Нейбауэра и разводили в гематиметрической пипетке, используемой в качестве разбавляющего раствора для жидкости Gower. Объем упакованных клеток (Ht) выполняли с использованием микрогематокрита. Гемоглобин (Hg) определяли количественно методом, который превращает гемоглобин в цианометемоглобин. Средний корпускулярный объем (MCV), средняя корпускулярный гемоглобин (MCH) и средняя корпускулярная концентрация гемоглобина (MCHC) также были определены количественно.Подсчет лейкоцитов проводили по общему количеству лейкоцитов (Leu) в модифицированной камере Нейбауэра. Дифференциальный подсчет лейкоцитов проводили на мазках крови, приготовленных из свежей крови и окрашенных панхроматическим Розенфельдом. В каждом мазке крови 100 лейкоцитов дифференцировались и классифицировались как нейтрофилы с ядром в стержне (Nrd) или с сегментированным ядром (Nsg), эозинофилом (Eos), базофилом (Bas), лимфоцитом (Lym) и моноцитом (Mon ) [ 33 ]
2.5. Статистический анализ
Различные статистические модели были использованы для анализа различных собранных переменных. Все переменные были проверены на нормальность по критерию Шапиро – Вилка и гомоскедастичность по критерию Левена. Учитывая, что результаты были получены на одном и том же животном в разное время, переменные RF, RT, TT, CT, HS и AHS были выполнены с помощью анализа повторных измерений с использованием модели, включающей два фиксированных воздействия, периоды (P1 и P2 ) и время (0700 ч, 1000 ч, 1300 ч, 1600 ч, 1900 ч и 2200 ч). Ранее сферичность анализировалась с помощью теста Моухли. Взаимодействие между факторами (периодами и временем) было выполнено с учетом случайного воздействия животного как остатка. Когда взаимодействия были значительными, регрессионный анализ использовался для определения реакции зависимых переменных как функции времени. Для переменных скорости потоотделения,+ , K + , Er, Hg, Ht, MCV, MCH и MCHC) и лейкоциты (Leu, Mon, Lym, Eos, Bas, Nsg и Nrd), были проведены повторные анализы с использованием периодов в качестве фиксированный эффект (P1 и P2) и случайный эффект животного, используемого в качестве остатков. Когда произошла значительная разница в ANOVA, средние значения сравнивались с помощью специального теста Тьюки. Кроме того, GLM ANOVA была выполнена, рассматривая день внутри периода как случайный фактор, проверяя наличие тренда за дни внутри периодов.Все анализы были выполнены с использованием пакета программ SPSS версии 22 Copyright IBM Corp Armonk, Нью-Йорк, США.Комитет по этике подтвердил в соответствии со следующим Законом 11.794 от 8 октября 2008 года, Указом 6899 от 15 июля 2009 года, что все процедуры, проводимые в этом исследовании, соответствуют этическим стандартам. Животные, использованные в эксперименте, были предварительно одобрены Комитетом по этике, получив номер протокола № 8702060420.