Введение в ядро клетки функционального гена, называемого трансгеном, представляет собой сложную операцию, которая начинается с выбора системы доставки (вектора генной терапии).
Хороший вектор должен отвечать многим требованиям:
- Манипуляция: вектором следует легко манипулировать для рекомбинации и размножения в подходящих хозяевах.
- Высокая способность к клонированию: вектор должен позволять вводить один или несколько генов и регуляторных последовательностей, гарантирующих желаемое пространственное и временное ограничение экспрессии трансгена.
- Минимальная инвазивность: вектор не должен вызывать неконтролируемых или нежелательных изменений генома хозяина. Интеграция вектора в клеточный геном может вызвать инсерционный мутагенез.
- Селективность для клеточной мишени: трансген должен быть экспрессирован исключительно в клетках-мишенях.
- Отсутствие иммуногенности: вектор не должен содержать генов, вызывающих иммунные реакции или другие факторы, которые могут быть вредными для организма.
- Стабильность с течением времени: вектор должен переноситься без изменений в клеточном потомстве и/или должен обеспечивать правильную и длительную экспрессию трансгена (трансгенов).
Доступные векторы генной терапии относятся к двум широким категориям: вирусные и невирусные.
Невирусные векторы
Новирусные векторы обладают некоторыми преимуществами, такими как пониженная патогенность, низкая стоимость и простые технологии производства. Однако ДНК, доставляемая невирусными векторами, должна преодолевать ряд внеклеточных и внутриклеточных барьеров, ограничивая эффективность трансфекции. Фактически эффективность трансфекции ограничивается преждевременным высвобождением генетического материала в кровоток и его последующей деградацией нуклеазами сыворотки крови при внутривенном введении, в то время как эндоцитозная ДНК в значительной степени деградирует по пути эндосома/лизосома до того, как она достигнет ядра.
Помимо прямого введения и микроинъекции ДНК в ядро, были разработаны физические методы и химические носители для улучшения доставки обнаженной ДНК в клетки и ткани. Часто используемыми невирусными средствами доставки являются катионные полимеры и катионные липиды, эффективность которых зависит от катионного заряда, насыщения и стабильности линкера.
Для повышения стабильности ДНК в циркуляции было изучено несколько стратегий. Одним из примеров является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Другой подход заключается в использовании био-реагирующих полимеров, использующих химико-физические свойства биологической микроокружения (pH, наличие восстановителей и т.д.) для содействия высвобождению генетического материала исключительно внутриклеточно. Другими проверенными стратегиями являются ацетиловые связи, разрушающиеся при рН эндосомальной среды, или дисульфидные мосты, которые снижаются в цитозоле.
Вирусные векторы
Независимо от происхождения, порядка и семьи, вирусы разработали очень тонкие стратегии для достижения и проникновения в конкретные клеточные мишени. Их использование в генной терапии заключается в их врожденной способности доставлять и выражать генетическую информацию в клетках-хозяевах. Репликация-дефективные вирусные векторы обычно происходят от вирусов дикого типа, в которых терапевтический ген (гены) вводится в вирусный ген, заменяя "дикие" гены, необходимые для литического цикла, тем самым предотвращая репликацию вируса и оказывая цитотоксическое воздействие на клетки-мишени. Однако эти гены могут быть заменены трансформирующими факторами путем развития специфических клеточных линий или использования вспомогательных вирусов в процессе производства.
Среди всех вирусных векторов наиболее характерными и используемыми для адресации ЦНС являются ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы и вирусы простого герпеса. Эти векторы различаются по грузоподъемности, клеточному тропизму и способности интегрироваться в геном хозяина, что может влиять на продолжительность экспрессии трансгена. Преимущества и недостатки, потенциальное применение ЦНС и побочные эффекты для каждого из вышеупомянутых векторов будут кратко рассмотрены ниже.