... Однако одни только данные о последовательностях обеспечивают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Поэтому, чтобы исследовать потенциал появления (то есть возможность заражать людей) циркулирующих CoV летучих мышей, мы создали химерный вирус, кодирующий новый, зоонозный белок-шип CoV - из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей1. в контексте SARS-CoV, адаптированных к мышам, основной цепи. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового белка шипа вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном скелете. Используя этот подход, мы охарактеризовали CoV-инфекцию, опосредованную пиковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунных терапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе эта стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.
Последовательности SHC014 и родственных RsWIV1-CoV показывают, что эти CoVs являются ближайшими родственниками эпидемическим штаммам SARS-CoV , однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяев: Y442, L472, N479, T487 и Y491. В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2. Этот факт подтверждается как экспериментами с псевдотипированием, в ходе которых измерялась способность лентивирусов, кодирующих спайк-белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие ACE2 человека, так и анализами репликации in vitro WIV1-CoV. Напротив, 7 из 14 остатков взаимодействия ACE2 в SHC014 отличаются от остатков в SARS-CoV, включая все пять остатков, критических для диапазона хозяев. Эти изменения в сочетании с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих пик SHC014, проникать в клетки, позволяют предположить, что пик SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Тем не менее, аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV, как сообщалось, позволили связать ACE27,8, предполагая, что для проверки требуется дополнительное функциональное тестирование. Таким образом, мы синтезировали шип SHC014 в контексте компетентного к репликации адаптированного к мышам скелета SARS-CoV (далее мы будем называть химерный CoV как SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность патогенеза и исследования вакцин на мышах. 2а). Несмотря на предсказания как из структурного моделирования, так и из экспериментов с псевдотипированием, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero. Чтобы оценить роль шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB / c 104 бляшкообразующими единицами (pfu) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15, Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность через 4 дня после заражения (d.p.i.); в отличие от этого, инфекция SHC014-MA15 приводила к значительной потере веса (10%), но без летальности у мышей. Изучение репликации вируса выявило почти эквивалентные титры вируса в легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15. Принимая во внимание, что легкие от мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в паренхиме легких 2 d.p.i., у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигена дыхательных путей, напротив, в паренхиме или в общем гистологическом балансе не наблюдалось дефицита окрашивания антигена, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15. Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, старых (12-месячных) животных. Животные, инфицированные SARS-MA15, быстро теряли вес и умирали от инфекции . Инфекция SHC014-MA15 вызывала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и картинах окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных. Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор, на основе экспериментов с мышами Ace2 - / -, у которых не наблюдалось потери веса или окрашивания антигена после инфекции SHC014-MA15 данные указывают на то, что вирусы с шипом SHC014 способны вызывать потерю веса у мышей в контексте вирулентного остова CoV.
Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами против вируса Эбола, такой как ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител против SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на остроконечный белок SARS-CoV, и они являются вероятными реагентами для иммунотерапии11,12,13. Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженную в процентах ингибирования вирусной репликации) и обнаружили, что тогда как SARS-CoV Urbani дикого типа был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (рис. 2a-d), Нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое с помощью фагового дисплея и избегания мутантов11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (Fig. 2a). Сходным образом, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV13, также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15.