Бактерии представляют собой одноклеточные микроорганизмы, достигающие в размерах нескольких микрометров и имеющие разнообразную форму. Эти микроорганизмы представляют собой одну из первых жизненных форм на Земле, поэтому относительно просто устроены, в связи с чем имеют большое практическое значение для генной инженерии. Бактерии обладают рядом отличительных свойств, которые делают их одними из лучших объектов в биотехнологии, и одно из них – высокая скорость роста. Например, широко применяемая кишечная палочка (Escherichia coli) способна делиться каждые двадцать минут при соблюдении оптимальных условий роста. Так, бактерии способны накапливать биомассу более чем в пятьсот раз быстрее, чем растения или животные. Кроме того, огромная, по сравнению с растениями и животными, метаболическая активность данных организмов делает их отличными продуцентами необходимых соединений. Обладая высокой пластичностью метаболизма, бактерии способно использовать в качестве питательных веществ отходы производства или же просто дешевые субстраты, что обуславливает экономическую выгоду их применения в биотехнологии.
Благодаря всем плюсам, применять бактерии в промышленности (начиная с получения лекарств и продуктов питания и заканчивая получением металлов из отработанной руды) очень удобно и выгодно, однако перед их внедрением необходимо получить высокопродуктивные штаммы, которые способны эффективно перерабатывать сырье в целевой продукт. Для этого используется генная модификация бактерий, а распространённым методом является применение плазмид.
Плазмидами называют небольшие кольцевые молекулы ДНК, которые находятся в клетке бактерий независимо от хромосомы, а их наличие совсем не обязательно для жизнедеятельности бактерии, однако часто эти кольцевые молекулы определяют весьма полезные для клетки признаки – например, устойчивость к антибиотикам. Так каким же образом происходит получения бактерий с нужными свойствами посредством введения плазмид? Более подробно процесс модификации я опишу на примере одной из наиболее распространенной плазмиды pBR322.
В любом процессе модификации первым этапом необходимо получить соответствующий ген с нужными свойствами. Данный ген можно получить либо из естественных источников, либо из геномной библиотеки. Далее необходимо сконструировать так называемый вектор – молекулу нуклеиновой кислоты, которая является переносчиком трансгена и доставляет его в клетку, которую мы модифицируем. В нашем примере в качестве вектора выступает плазмида pBR322, которая способна внедрятся в кишечную палочку (Escherichia coli). Чтобы правильно описать весь процесс, необходимо разъяснить некоторые определения.
Рестриктазы – это группа ферментов, которые способны узнавать определенный небольшой участок ДНК и делать надрез цепи ДНК в месте узнавания или недалеко от него. То есть, находя во всей цепи ДНК определенную небольшую последовательность из нуклеотидов, фермент делает разрез цепи в этой области.
Сайтом рестрикции называют короткую последовательность нуклеотидов, которую способна узнавать соответствующая ему рестриктаза.
Плазмида pBR322 изначально в своем составе несет гены, отвечающие за устойчивость к двум антибиотикам. В одном участке плазмиды присутствует ген устойчивости к ампициллину (Ampr), в другом – ген устойчивости к тетрациклину (Tecr). В данных участках присутствуют определенные сайты рестрикции, соответствующие рестриктазам. Нас интересуют сайты рестрикции, находящиеся в гене устойчивости к тетрациклину, позже станет ясно почему. В данном гене присутствует участок рестрикции для рестриктазы, имеющей название BamHI.
Предварительно трансген, который мы собираемся встроить в нашу плазмиду, необходимо подготовить, образовав на его конца такие же сайты рестрикции. Описание данного процесса я опущу. После того, как это сделано, необходимо, добавив рестриктазу BamHI, разрезать нашу плазмиду на сайте рестрикции. Теперь наша плазмида уже не кольцевая, а линейная, так как мы её разрезали в сайте рестрикции. Далее в место разреза встраивается нужным нам фрагмент, так как он также содержит последовательности, соответствующие сайту рестрикции, эти концы «склеиваются», и необходимый нам ген оказывает внутри плазмиды, а сама плазмида вновь приобретает кольцевую форму.
Из-за того, что мы сначала разрезали ген устойчивости к тетрациклину, а позже и встроили нужный нам трансген в него, то этот ген инактивируется, и плазмида впредь не дает бактерии устойчивость к тетрациклину. Далее полученный вектор в виде модифицированной плазмиды pBR322 внедряется в бактерию Escherichia coli. Для этого клетки бактерий обрабатывают ионами кальция, чтобы мембрана клеток стала проницаемой для ДНК.
Теперь необходимо отобрать клетки, в которые мы внедрили наш вектор, несущий нужный трансген. Именно для этого нам и необходимы гены устойчивости к антибиотикам, которые содержит плазмида pBR322. Для начала бактерии высеваются на среду, которая содержит в своем составе антибиотик ампициллин. С помощью этого мы можем отобрать бактерии, которые несут в своем составе данную плазмиду. Так как плазмида содержала ген устойчивости к этому антибиотику, то бактерии, в которые попала плазмида, начинают нормально расти на среде с этим антибиотиком, а те бактерии, в которые плазмида не проникла, угнетаются на этой среде. Первый этап выделения закончен – мы смогли отделить бактерии, которые содержат в своем составе плазмиду pBR322. Однако теперь стоит вторая задача – разделить клетки, в составе которых находится просто плазмида и клетки, в составе которых находится именно модифицированная плазмида с нужным нам геном. Именно для этого мы встраивали наш трансген в ген устойчивости к тетрациклину, так как при такой манипуляции, как было сказано выше, мы инактивировали эту устойчивость. Поэтому бактерии, которые несут не просто плазмиду, а именно модифицированную нами, не смогу нормально расти на среде с тетрациклином. Так, колонии бактерий, содержащие плазмиды, отпечатываются на среду (см. Метод реплик) с тетрациклином в своем составе. В результате отбираются бактерии, которые в своем составе содержат именно модифицированную нашим трансгеном плазмиду. Эти бактерии высеваются на обычную среду и в дальнейшем клонируются. Таким образом, мы получили клетки бактерии Escherichia coli со встроенным в них нашим трансгеном, которые мы уже можем использовать в нужных нам целях.
Кроме этого, существует еще большое количество различных плазмид, которые отличаются по наличию разного количества сайтов рестрикции, методам отбора полученных модифицированных бактерий и другим признакам. Кроме плазмид существуют и другие методы модификации бактерий (например, с помощью фагов), однако эта тема заслуживает отдельного описания, о чем я постараюсь написать в будущем.
А каково ваше мнение по этому поводу? Оставляйте ваши мысли в комментариях!
А чтобы получать больше интересных статей ПОДПИСЫВАЙТЕСЬ на канал. И помните, что ваши лайки - лучшая мотивация!