Груз ретровирусных элементов, содержащихся в геноме свиней — одна из основных помех ксенотрансплантации органов от свиньи к человеку. Ученые получили свиней, чей геном свободен от опасных для человека ретровирусных элементов, а часть белков гуманизирована для повышения иммуносовместимости.
Альтернативой обычной трансплантации может служить пересадка органов от свиньи к человеку — это возможно благодаря сходству в размере и физиологии органов и тканей. Главные препятствия для такой ксенотрансплантации — иммунная несовместимость между донором и реципиентом, приводящая к отторжению трансплантанта, а также эндогенные ретровирусы (PERV — porcine endogenous retrovirus), содержащиеся в геноме свиней и способные заражать человека.
Ранее были получены свиньи, которым инактивировали все 25 копий свиных ретровирусных элементов при помощи системы CRISPR/Cas9. На этот раз исследователям удалось получить генно-модифицированных свиней без ретровирусных элементов в геноме, а также с нокаутом трех основных ксеноантигенов и девятью внедренными человеческими генами. Препринт статьи опубликован на BioRxiv. Как и в предыдущей статье, среди ведущих авторов указаны Джордж Черч (Гарвардский университет) и Лухань Ян (Цихань Био, Ханчжоу Китай, ChinaeGenesis, Кембридж, США).
У свиней имеется три уникальных гликановых эпитопа, распознавание которых антителами приводит к развитию острой реакции отторжения при пересадке свиных органов человеку: галактозо-α-1,3-галактоза (α-Gal), синтезируемая α-1,3-галактозилтрансферазой (GGTA1), N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), в синтезе которой участвует гидроксилаза цитидинмонофосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты (CMAH), и так называемый SD-эпитоп, образующийся при участии β-1,4-N-ацетилгалактозаминилтрансферазы 2 (B4GALNT2). Решением проблемы послужил нокаут всех трех генов, участвующих в синтезе этих гликановых эпитопов.
Для дополнительного улучшения безопасности трансплантантов, получаемых от свиней, им внедрили человеческие гены регуляции системы комплемента (в том числе CD46, CD55, CD59). Предполагается, что это снизит риск привлечения NK клеток и макрофагов к трансплантанту и тем самым уменьшит вероятность отторжения.
Также в ходе редактирования свиного генома в нем «исправили» несовместимость между человеческой и свиной системами свертывания крови. Некоторые белки свиней недостаточно эффективно связываются с человеческими гомологами своих лигандов (например, тромбомодулин свиней не связывает человеческий С-реактивный белок), что влечет за собой нарушения свертываемости крови, например, системную коагулопатию и тромботическую микроангиопатию.
Для получения трансгенных свиней сначала создали генетически модифицированные клетки фибробласта свиньи. Затем, просеквенировав полученные клетки, выбрали те клоны, которые несли все необходимые модификации, и пересадили их ядра в яйцеклетки. Выращенные таким способом свиньи были подвергнуты глубокому секвенированию для подтверждения того факта, что их геном содержит все необходимые модификации, и при этом не несет следов неспецифического CRISPR-редактирования. (Инсерции были обнаружены в двух неспецифических сайтах из потенциальных 1200, причем обе они не влияли на белок-кодирующую последовательность.) Окрашивание образцов клеток на соответствующие поверхностные белки подтвердило, что у модифицированных свиней существенно снижен уровень экспрессии трех ключевых ксеноантигенов, зато присутствует экспрессия человеческих белков. Иммуносовместимость с человеком также была подтверждена введением человеческих иммуноглобулинов, которые у свиней дикого типа провоцируют реакцию иммунной системы организма: у модифицированных свиней такой реакции не отмечалось.
Ученые проверили, к каким негативным последствиям для организма самой свиньи может привести подобное генетическое вмешательство. Проверке подвергали, в частности, функционирование основных жизненно важных органов (печень, сердце, почки), состав крови и способность к полноценному размножению. Ни в одной из систем отклонений от нормальной физиологии не выявлено. Также исследователи убедились, что все внесенные модификации наследуемы.
По словам авторов статьи, успешное создание таких генетически модифицированных свиней — существенный шаг к безопасной и эффективной ксенотрансплантации.