Орден Piroplasmida содержит разнообразную группу внутриклеточных паразитов, многие из которых могут вызывать серьезные заболевания у человека, домашних животных и дикой природы. Исторически эти паразиты идентифицировались на основе их хозяев или морфологических характеристик, но последние молекулярные исследования выявили гораздо больший диапазон и разнообразие хозяев. В настоящее время Пироплазматика включает несколько родов, например, Cytauxzoon, Theileria и Babesia.
В дикой природе было отмечено большое разнообразие видов Babesia spp. и связанных с ними пироплазмов, и некоторые популяции широко распространены в некоторых регионах Северный енот, пума Флорида и североамериканская речная выдра, но мало известно о естественной истории, географическом распределении и разнообразии видов Babesia. На сегодняшний день из енотов поступили сообщения о двух видах пироплазмов: Babesia lotori и Babesia sp., тесно связанной с Babesia microti; и др. Многие исследования пироплазмов енотов основывались на морфологической идентификации паразита, которая не отличалась чувствительностью и специфичностью, необходимыми для распознавания двух морфологических сходств B. spp.
Методы
1. Взятие проб
Пробы были случайно взяты у енотов из различных мест в Соединенных Штатах. Образцы были взяты в реабилитационных учреждениях, зоопарках, ветеринарных клиниках, биологах, диагностических лабораториях и т.д. с июня 2015 года по май 2018 года. Тип образца варьировался, но большинство образцов состояло либо из цельной крови, либо из селезенки. Пробы хранились при температуре -20 C до момента извлечения ДНК.
2. Молекулярное тестирование
Геномная ДНК была извлечена из ткани ∼10 мг или 100 мкл цельной крови с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя. Для амплификации области V4 гена 18S рРНК группы B. microti-подобных spp. или группы B. s. spp. были использованы два различных метода скрининговой полимеразной цепной реакции. Размеры ампликонов были тщательно изучены, поскольку сообщалось, что из-за схожести последовательности в области связывания грунтовок, B. microti-подобная Spp. и западная группа Babesia могут быть усилены B. s. primer set, если было большое количество копий B. microti-подобных, но размер ампликонов был 371bp вместо ожидаемых 341bp, 2003 и др.
Для определения филогенетических связей было проведено секвенирование генов 18S рРНК почти полной длины на случайном наборе образцов в каждом географическом регионе. Для изучения внутривидовых вариаций между регионами также проводилась амплификация гена 1-й субъединицы цитохромной оксидазы c.
Были приняты стандартные меры предосторожности для предотвращения или обнаружения загрязнения, т.е. для проведения экстракции ДНК, настройки ПЦР реакции и анализа продукции в отдельных и специально отведенных лабораторных помещениях. Отрицательный контроль воды был включен в каждый набор экстракции ДНК и для каждого набора ПЦР реакций. Положительный контроль включал образцы с подтвержденной последовательностью B. lotori-like и B. microti-подобных видов. Ампликоны визуализировали в геле с гелем Биотиум Фримонт, окрашенном на 1,5% агарозой.
3. Секвенирование и филогенетический анализ
Часть репрезентативных ампликонов из каждого географического региона была очищена от гелей с помощью коммерческого гелеочистительного набора и двунаправленной последовательной очистки в Центре геномики Университета Джорджии. Последовательности были выровнены в MEGA, визуально проанализированы и обрезаны, чтобы включить как можно больше последовательностей. Поскольку несколько последовательностей были идентичны, только одна уникальная последовательность из каждой группы была включена в анализ. Последовательности в GenBank были включены в качестве представителей каждой группы пироплазмов для сравнения на основе предыдущих исследований пироплазмов енотов и других хищников. Филогенетические деревья построены с использованием алгоритма максимальной вероятности в МЕГА.
Результаты
1. Распространенность и распределение двух пироплазменных групп
На основании первичного скрининга ПЦР, направленного на ген 18S рРНК, распространенность любой инфекции Babesia у енотов во всех местах составила 73,2%. Из них 70,1% енотов были положительны на B. microti-подобные sp. инфекции, 24,3% - на B. s. и 21,6% - на PC.
В целом распространенность группы B. s. s. была высокой на юго-востоке/средней Атлантике и низкой на Среднем Западе США/ Онтарио и на западе США. Инфекции Babesia microti-подобные sp. infections были распространены во всех местах исследований, за исключением Новой Шотландии, где только 6% были положительными, и Айдахо, где не было B. microti-подобных sp.
2. Генетическая характеристика
Подмножество случайных положительных проб было отобрано для анализа последовательности для изучения видового разнообразия и вариации в пределах географического ареала, включенного в исследование. Из них 43 образца имели высококачественные последовательности для одной или нескольких мишеней генов. Результаты скрининговых анализов ПЦР не всегда согласовывались с результатами секвенирования, и некоторые образцы амплифицировались как различные виды на основе гена-мишени.