Пироплазмозы являются важными глобально распространенными клещевыми заболеваниями домашних и диких животных, вызываемыми апексомплексангемопаразитами рода Babesia и Theileria. Значение этих патогенов в северном полушарии в последние годы возросло, поскольку некоторые из них могут вызывать заболевания, которые считаются возникающими зоонозами.
Распространение инфекций как Babesia, так и Theileria зависит от нескольких факторов, в основном от наличия соответствующих видов клещей-переносчиков, а также подходящих хозяев и резервуаров. Хотя Babesia spp. может передаваться широким спектром родов клещей, включая Rhipicephalus, Haemaphysalis, Hyalomma и Dermacentor, следует отметить, что наиболее распространенный тик в Европе, Ixodes ricinus, был определен в качестве переносчика некоторых видов.
Материалы и методы
1. Сбор и хранение проб
В общей сложности 174 косули, добытой в 14 испанских провинциях в течение пяти лет, были изучены в рамках данного исследования. Пробы были собраны охотниками Испанской ассоциации косуль; научные сотрудники ACE контролировали отбор проб, чтобы обеспечить правильный метод отбора проб и избежать перекрестного заражения.
Места охоты были классифицированы по четырем различным описанным ранее экологическим зонам: Океанический, горный, континентальный и средиземноморский. Кроме того, большинство косуль были самцами и только 51 самка, так как охотничий период для самцов длиннее, чем для самок. Возраст был оценен на основе анализа зубов; таким образом, животные были разделены на 2 возрастные группы, моложе 2 лет и взрослых старше 2 лет.
2. Извлечение ДНК и полимеразная цепная реакция
ДНК была извлечена из 200 мг ткани селезенки с помощью коммерческого набора согласно инструкциям производителя по извлечению ДНК из ткани, а затем хранилась при температуре -20 °C.
Для обнаружения ДНК Babesia и Theileria была выполнена коммерческая ПЦР в режиме реального времени, которая обнаруживает оба вида пироплазм в соответствии с инструкциями производителя. Затем все положительные образцы qPCR были отобраны и молекулярно охарактеризованы с помощью обычного ПЦР-анализа, направленного на ген 18S рРНК Babesia spp. и Theileria spp. с использованием ранее зарегистрированных праймеров и протоколов. Для выявления коинфекций Babesia-Theileria все положительные образцы были дополнительно проанализированы с использованием двух ПЦР 18S рРНК, специфичных для Babesia и Theileria.
3. Анализ последовательности
Все продукты, полученные с помощью обычных ПЦР-анализов, были очищены и затем секвенированы в обоих смыслах на ABI 3730xl® с использованием набора циклического секвенирования Big dye Terminator v3.1 в отделе секвенирования и анализа фрагментов.
Результаты
Используя qPCR, 156 из 174 образцов селезенки дали ДНК Babesia и/или Theileria. Все qPCR-положительные образцы также амплифицированы на ген 18S рРНК, но секвенирование прошло успешно только в 129 образцах, у 27 образцов в электроферограмме были сигналы, которые препятствовали точному считыванию последовательностей.
После анализа последовательности, общая распространенность для Theileria spp. и Babesia spp. составила 60,9% и 19,0%, соответственно. Смешанные инфекции Babesia/Theileria были выявлены у 10 животных. При анализе возможного влияния пола животных на распространенность инфекции, оба пола показали одинаковый процент инфицирования Babesia spp. В противоположность этому, распространенность Theileria spp. была выше у мужчин, чем у женщин. Результаты логистической регрессии показали, что различия в распространенности Theileria были незначительными.
Большинство последовательностей T. sp. OT3 в рРНК 18s были идентичны или имели один нуклеотидный полиморфизм по сравнению с контрольным изолятом T. sp. OT3 KF470868; было обнаружено более 7 различий нуклеотидов с другими видами Тейлерии. В ITS1, напротив, наши последовательности T. sp. OT3 показали только 97% сходство с осажденными последовательностями T. sp. OT3, полученными от овец в Китае. Большинство изолятов B. venatorum показали от одного до трех SNP по сравнению с KM289158 в гене 18S рРНК, в то время как на ITS1 наблюдалась 100% идентичность с референтной последовательностью HM113372. Последовательности капреоли Babesia у гена 18S рРНК были идентичны или показали один SNP по сравнению с KX839234. Хотя последовательности B. capreoli на гене ITS1 в настоящее время не депонированы в GenBank, изоляты ITS1 B. capreoli показали 94% сходство с ITS1 гена B.ivergens и перекрыли 23% последовательности 18S рРНК, соответствующей B. capreoli.
Последовательность T. sp. 3185/02 показала одно SNP по сравнению с контрольной последовательностью DQ866842 и более 5 нуклеотидных расхождений по сравнению с другими видами Тейлерии. Что касается B. capreoli, то последовательности ITS1 T. sp. 3185/02 в настоящее время не осаждаются в GenBank, и наиболее похожей последовательностью был фрагмент гена ITS1 T. sp. OT3 с гомологией 76%. Наконец, одиночный изолят показал 99-процентное сходство с контрольной последовательностью B. bigemina.