Пять семейств лемуров относятся к наиболее уязвимым группам позвоночных животных в мире, 94% из 101 вида которых находятся под угрозой исчезновения со стороны Международного союза охраны природы. Эндемичное для "горячей точки" биоразнообразия Мадагаскара, разнообразие лемура особенно примечательно, учитывая, что Мадагаскар представляет лишь небольшую часть тропической суши. Угрозы для лемуров главным образом включают утрату среды обитания и охоту на кустарники в результате неустойчивого землепользования и добычи ресурсов, вызванного нищетой и наследием политической нестабильности. Сегодня площадь лесов Мадагаскара составляет 92 200 км2. В период с 2000 по 2010 год страна потеряла 9700 км2 леса, что почти в три раза больше, чем в предыдущем десятилетии.
Интродуцированные хищники также могут опустошить популяции лемура, но это не получило достаточного внимания исследователей. Во всем мире домашние собаки свободного выпаса влияют на животных в результате хищничества, конкуренции, гибридизации и передачи заболеваний. На Мадагаскаре было показано, что популяции свободно перемещающихся собак оказывают негативное влияние на популяции лемуров и многие другие эндемические виды диких животных; однако перенос патогена от собак к местной дикой природе еще не изучен.
Материалы и методы
В дополнение к сбору крови у лемуров-мышей, 5 мкл цельной крови было также собрано у 18 собак, живущих в RNP и вокруг него, в ходе кампании стерилизации и вакцинации для местных собак. Эти образцы были собраны на картах памяти TropBio Blood Spot.
Все образцы были отобраны с помощью комплекта Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit и проверены на наличие филярных паразитов с помощью "панфилярного" первичного набора, предназначенного для получения ампликона из филярных червей путем усиления последовательности 1bS-2b в сегменте 5.8S-2. Мастер-микс ПЦР составлялся путем объединения 11 мкл безядерного H2O, 5 мкл 5× фирового реакционного буфера, 0,5 мкл dNTPs, 1 мкл каждого праймера, 0,5 мкл фермента Фира и 1 мкл образца ДНК, что позволило получить общий объем 20 мкл. Термический цикл длился 95 °C в течение 30 с, затем 35 циклов денатурирования, отжига и расширения; окончательное расширение и выдержка при 4 °C в термоцикле скважины Veriti 96. Затем препараты ПЦР запускали на 1,5% агарозном геле и визуализировали на наличие полос. Ожидаемый размер ампликона в результате усиления мишени D. immitis составлял 542 п.п., и два образца производили различные полосы, которые, как представляется, были примерно такого размера. Эти образцы были подвергнуты циклическому секвенированию с использованием 4 мкл красителя Big Dye, 2 мкл праймеров и 4 мкл ПЦР-продукта. Для каждого положительного образца были подготовлены две реакции секвенирования с использованием прямых и обратных праймеров. Циклический протокол был настроен на 25 полных циклов по 96 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 4 минут. Продукты реакции очищались колоннами EdgeBio в соответствии с протоколом производителя. Затем очищенные продукты были секвенированы с помощью генетического анализатора ABI 3130xl, и полученная последовательность была подвергнута анализу BLAST. Результаты BLAST показали однозначное присутствие D. immitis в обоих проанализированных образцах.
Для верификации положительные образцы D. immitis были также амплифицированы с использованием протокола обнаружения ПЦР, специфичного для D. immitis-гнездовой ПЦР, праймеры которого были нацелены на ген 5S-rDNA и праймеры для вложенных праймеров, направленных на область прокладки внутри этого гена. Как начальные, так и вложенные реакции ПЦР проводились в объеме 50 мкл с использованием рецептур и циклических протоколов, описанных в.
Результаты и обсуждение
Секвенирование очищенных "панфилярных" продуктов ПЦР в сочетании с БЛАСТ-анализом этих результатов подтвердили наличие ДНК D. immitis в обоих образцах. Вложенный анализ ПЦР с последующим секвенированием обеспечил дальнейшее подтверждение позитивности в одном из двух "панфилярных" положительных образцов. Вложенная ПЦР не смогла получить продукт с последовательностью качества из другого "панфилярного" положительного образца, в результате чего извлеченная ДНК была исчерпана. Однако отсутствие результатов секвенирования вложенного ПЦР-анализа второго образца не исключает возможности обнаружения D. immitis, подтвержденного секвенированием продуктов "панфилярного" анализа. При сравнении в GenBank с другими известными группами Dirofilaria spp. и другими нематодными аутгруппами, наши образцы совпали специально с D. immitis. У инфицированных лиц не было обнаружено никаких респираторных или сердечных нарушений или каких-либо других диагностически значимых симптомов.
Помимо обнаружения D. immitis в образцах лемура, семь собак, отобранных у RNP, при тестировании с использованием описанного выше метода "Pan-filarial" анализа производили гелеобразующие полосы. В трех из этих образцов были получены последовательности, которые были близко согласованы с D. immitis.