Продолжение статьи https://zen.yandex.ru/profile/editor/id/5dc482c03642b600ae35d80f/5dd5773f3112ab60c73553fa/
Выращенные в агаре культуры следующих видов, некоторые из которых имеют меланизированные структуры, предположительно устойчивые к деградации, были получены из коллекции, хранящейся в Университете Висконсин-Мэдисон: Allomyces javanicus (Blastocladiomycota), несущей устойчивые к спорангии и зооспорангии; Phycomyces blakesleeanus (Mucoromycotina) со спорангией на длинных спорангиофорах и зигоспорангией, Mucor hiemalis (Mucoromycotina) с зигоспорангией и спорангией и Absidia sp. (Mucoromycotina) с зигоспорангией и спорангией; и аскомицеты Penicillium rubens, Chaetomium globosum с перитецией,Anthracobia muelleri с apothecia, Aspergillus chevalier с конидиеносцами и cleistothecia, Aspergillus flavus со склеротией, Sclerotina sclerotiorum со склеротией, Sordaria fimicola с перитезией, периферическая полость позвоночника, слизистая оболочка позвоночника и слизистая оболочка со штоком.
Полевые коллекции и выращенные в теплицах образцы личиночного марганцевого сусла Conocephalum conicum были источниками гломановых гиф с характерными крупными спорами. Выращивание тепличного материала ранее было показано микроскопическими методами для удержания грибных гифных масс в клетках коры и разветвленных гифах, выходящих из печеночного сусла, которые были сходны с глимановыми гифами. Метагеномные методы ранее использовались для указания того, что микробиом собранного в полевых условиях материала включал по меньшей мере один тип гломалеинового гриба.
Окрашивание лактофенолом ватным синим и светлопольную микроскопию использовали для визуализации гиф и спор, имеющих отличительные признаки гломалеанов (и других грибов) в тканях секвенированного собранного полевого материала, в соответствии с предыдущими микроскопическими наблюдениями внутриклеточных и межклеточных гиф, приписываемых гломеромикотам в пределах C. conicum (и некоторые другие виды печеночников), полученные из естественных мест обитания в Латвии.
Ацетолиз
Оценивалась устойчивость к деградации образцов грибов с помощью стандартной процедуры ацетолиза, используемой для оценки устойчивости к распаду биологических материалов. Процедура ацетолиза проводилась в химической вытяжке внутри пробирок Эппендорфа с крышками, которые были перфорированы, чтобы позволить выход пара. Грибной материал сначала обезвоживали в ледяной уксусной кислоте при комнатной температуре в течение по меньшей мере 15 минут.
Затем пробирки Эппендорфа, содержащие грибной материал в 9-1 по объему растворе уксусного ангидрида и серной кислоты, плавали в вертикальном положении в кипящей воде, содержащейся в стакане из нержавеющей стали, на горячей плите в течение по меньшей мере 20 минут. После удаления пробирок из кипящей воды кислотную смесь осторожно удаляли, а осадочные остатки промывали сначала в ледяной уксусной кислоте, а затем в воде. Во время этого процесса между стадиями обработки использовалась микроцентрифуга для осаждения микроскопических остатков, что позволяло удалять супернатант с минимальной потерей органических остатков.
Предыдущие исследования ацетолиза показали, что остатки могут сохранять прежний бледный или золотисто-коричневый цвет или что ацетолиз может придавать золотисто-коричневый цвет к материалам, которые были бледнее в жизни.
Обработки изображений
Изображения яркого поля, поляризованного света или аутофлуоресценции остатков ацетолиза были получены с использованием микроскопа Zeiss Axioplan, оснащенного фильтрами ультрафиолетового (UV; G365 FT395 LP420) и фиолетового (395-440 FT460 LP470). Автофлуоресценция при ультрафиолетовом и фиолетовом возбуждении была оценена, поскольку эта особенность, как сообщалось, коррелирует с присутствием фенольных полимеров клеточной стенки в устойчивых к ацетолизу и распаду тканях бриофитов и родственных стрептофитных водорослей, и грибной меланин также является устойчивым к кислотному гидролизу полифенольным компонентом клеточной стенки, что можно ожидать, чтобы показать специфическую автофлуоресценцию. Изображения LM были записаны в цифровом виде с помощью камеры Nikon D300. Для СЭМ остатки ацетолиза были установлены на алюминиевые заглушки, на которые был нанесен углеродный токопроводящий язычок с адгезивным покрытием (Ted Pella, Redding, CA). Затем образцы были покрыты напылением золотом, и изображения были получены в режиме высокого вакуума при 15 кВ с использованием FEI вольфрам Quanta 450 Environmental SEM.
Для ПЭМ свежие образцы C. conicum из теплицы Иллинойского государственного университета фиксировали в течение 4 часов в 2% глутаральдегиде в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7), промывали в буфере 6 × 10 минут, затем фиксировали в течение 1,2 часа в 2% OsO 4 , промывают в буфере, обезвоживают в ряду градуированных ацетонов, просачивают и внедряют в смолу Спурра. Тонкие срезы ризоидов разрезали алмазным ножом, окрашивали цитратом свинца и визуализировали с помощью Zeiss EM10 TEM.
Полученные результаты
Остатки ацетолиза, восстановленные в этом исследовании, включали определенные типы гиф; конкретные спорангиофоры или конидиеносцы; различные виды спорангиев, иногда включая опорные клетки; zygosporangia; ascocarps; и споры. Некоторые таксоны не оставили никаких остатков, кроме аморфных остатков, в которых клеточная структура не была обнаружена, а некоторые таксоны не оставили никаких клеточных остатков, кроме спор.
Грибные гифы
Большинство грибных гиф, протестированных в этом исследовании, не пережили ацетолиз. Примечательно, что ни один скелет или другие типы гиф Ganoderma не выжили после ацетолиза. Тем не менее, отдельные гифы с коричневыми стенками грибов с неопределенной классификацией, которые были связаны с собранным в поле Conocephalum conicum, пережили ацетолиз, сохранив цвет. Отличительные споры и прикрепленные гифы гломалеиновых грибов, встречающиеся у выращенных в теплицах и собранных в полевых условиях C. conicum, пережили ацетолиз, и после ацетолиза у них был золотисто-коричневый цвет. Гломалеиновые споры и гифы остаются прикрепленными к спорам с автофлуоресцентным желто-зеленым при фиолетовом возбуждении и сине-белым при ультрафиолетовом возбуждении (данные не показаны). ТЕМ обнаружил, что предполагаемые глимановые гифы (диаметры которых соответствовали диаметрам гиф, прикрепленных к спорам, наблюдаемым в ЛМ), обладали более электронно-непрозрачными клеточными стенками, чем ассоциированные ризоиды печеночника большего диаметра, и ни один тип клеточной стенки не разрушился во время обработки.
Среди других образцов, протестированных с ацетолизом, были извлечены только клубки коричневого цвета, разветвленные, регулярно разделяющиеся гифы Sordaria fimicola и несколько небольших кусочков коричневых гиф Anthracobia muelleri. Ни один из этих гиф, устойчивых к ацетолизу, не был автофлуоресцентным при исследовании с фиолетовым или ультрафиолетовым возбуждением.
Спорангиофоры и конидиеносцы
Заметные спорангиофоры Phycomyces blakesleeanus были обнаружены в виде больших коричневых трубок, иногда имеющих более мелкие трубки внутри. Маленькие конидии и гифы неопознанной плесени были получены из ацетолизированных культур P. blakesleeanus и Allomyces javanicus . Золотисто-коричневые остатки характерных конидиеносцев и фиалидов Aspergillus chevalier были обнаружены вместе со спорами и cleistothecia. Ни один из устойчивых спорангиофорных или конидиеносных материалов не был автофлуоресцентным при исследовании под воздействием УФ или фиолетового возбуждения.
Спорангия, зигоспорангия и аскокарп
Многие колбоподобные устойчивые спорангии A. javanicus пережили ацетолиз. СЭМ показала, что устойчивые к ацетолизу стенки A. javanicus sporangia включали базальную стенку, которая прикрепляла спорангий к нестойким гифам в живых условиях. SEM также выявила спорангиальную поверхность, тонко украшенную ямками, которая не была фибриллярной и иногда имела складки или разрывы. Ассоциированные nonsporangial клетки показаны линейные углубления.
Глобозная бесполая спорангия у Phycomyces blakesleeanus пережила ацетолиз; спорангиальные остатки и замкнутые и высвобожденные споры автофлюоресцируются сине-белым в УФ-свете и желтым в фиолетовом возбуждении. Отчетливо орнамент, золотисто - коричневый цвет остатки P. blakesleeanus zygosporangia и суспензоров также были восстановлены. Не осталось остатков зигоспорангии или суспензий Mucor hiemalis или Absidia sp. были восстановлены. В дополнение к cleistothecia A. chevalier, отчетливо покрытая волосами перитеция Chaetomium globosum (данные не представлены) и глобозная до грушевидной перитеции Sordaria fimicola пережила ацетолиз.
Грибковые Споры
Бледно-окрашенные остатки спор были обнаружены у Phycomyces , Anthracobia , Chaetomium и Ganoderma; конидии были извлечены из Aspergillus flavus и A. chevalieri (данные не представлены). Никакие остатки спор не были автофлуоресцентными при ультрафиолетовом или фиолетовом возбуждении, за исключением ранее описанных бесполых спор, связанных с C. conicum glomalean, и бесполых спор Phycomyces.
Выводы об этом исследовании читайте в следующей статье.