Библиотеки клеток с определенными генетическими изменениями доказали свою преобразующую способность для соединения плохо изученных генов с биологическими путями и для выявления новых ролей для ранее охарактеризованных генов.
Несмотря на эти преимущества, высокая стоимость разработки и потребность в значительных временных и трудовых затратах привели к тому, что было разработано лишь небольшое количество таких библиотек.
- Более того, даже в некоторых наиболее широко используемых коллекциях, таких как библиотека дрожжевых нокаутов, большинство членов содержат нежелательные вторичные мутации и появление ложноположительных результатов скрининга из-за наличия в геноме селекционных маркеров, поражающих соседние гены.
По мере того, как продолжаются расширяться границы геномики, существует острая необходимость в масштабируемых методах, которые позволяют быстро и экономически эффективно создавать множества клеток, каждая с точными генетическими изменениями.
Эти технологии получили бы дальнейшее развитие, если бы переход от создания библиотеки к ее просмотру, был бесшовным, и все сгенерированные варианты можно было бы просмотреть в рамках одного эксперимента. В таких работах представляют стратегию Cas9, основанную на одновременном создании сотен генетических вариантов в дрожжевых клетках дикого типа, экспрессирующих белок Cas9 вместе с шаблоном донорского ремонта.
Используя эту платформу, создаются две библиотеки, ориентированные на ДНК-вертолетку SGS1:
- одну, содержащую набор небольших мутантов для удаления плитки, которые охватывают всю длину белка
- другую, кодирующую серию точечных мутаций против высококонсервативных остатков в нем.
Используются библиотеки мутантов для детальной характеристики доменной архитектуры и функциональных остатков в SGS1, которые имеют решающее значение для ее роли в поддержании генома. Затем создается библиотека генома, охватывающую несколько сотен плохо охарактеризованных небольших открытых рамок для чтения, разбросанных по геному дрожжей, и оцениваем их в одном наборе экспериментов, что необходимо для роста в различных условиях окружающей среды.
Такая система основана на CRISPR/Cas9, которая ранее показала, что способна улучшить редактирование генома в Saccharomyces cerevisiae путем стимуляции гомологично-направленной рекомбинации при возникновении двухцельного разрыва на заданном локусе. Каждый изогенный мутант генерируется путем введения плазмиды, содержащей направляющую РНК-мишени в паре соответствующим донорским шаблоном, который содержит предполагаемую мутацию.
Преимущества такого объединенного проекта Guide+Donor заключаются в трех аспектах:
- возможность быстрого клонирования всех членов библиотеки в рамках одного набора реакций;
- возможность одновременной доставки руководства и донора в единое целое, что позволяет избежать развязки, которая может привести к неэффективному ремонту и непродуктивным результатам;
- возможность высокопроизводительного молекулярного генотипирования с использованием уникальной последовательности следующего поколения для каждого руководства, использующего штрих-код для отслеживания клеток. Аналогичное представление о доставке руководства+донора в СнГ было недавно продемонстрировано в отношении бактерий.
В качестве теста этой системы гид+донор была интегрирована копия гена Cas9 в нейтральный локус HO, а затем преобразовали его в гид+донор, содержащий плазмиду, предназначенную для отключения локуса ADE2. Однако при выборе клеток с гидом+донором было обнаружено, что количество колоний с желаемыми генетическими изменениями было низким (<5%), что согласуется с ранее предпринятыми попытками в СнГ провести гида+донорские роды у дрожжей.
- Представляется высокопроизводительный метод для быстрого создания и фенотипической характеристики сотен мутантов и иллюстрируется его потенциал в картировании доменов/остатков и функциональном опросе практически любой генетической мишени, определенной пользователем.
Чтобы понять сильные и слабые стороны метода Guide+donor, некоторые эмпирически определили конструктивные параметры, необходимые для эффективного создания программируемых мутаций, а именно удаления, замены аминокислот и замены последовательностей. Это позволяет массово создавать определенные пользователем специфические потери функции, усиление функции и модифицированные регуляторные мутанты. Более того, редактируя локус в его родном контексте без необходимости использования экзогенных маркерных генов, мы избегаем артефактов от использования суррогатных систем отчетности и ложноположительных и отрицательных результатов из-за позиционного эффекта выбора маркера.
Кроме того, тот факт, что такая система является высокоэффективной, позволяет пользователям просто прочитать инструкцию+донорскую последовательность, представленную в плазмиде, доставленной в каждую клетку, и, таким образом, определить генотип клетки. В конечном счете, эта особенность позволяет отслеживать пригодность сотен мутантов и, возможно, тысяч, путем простого определения последовательности в изобилии каждой последовательности гидов-доноров в популяции.
- В итоге эту платформу проверили, используя хорошо отработанную ДНК-версию вертолета SGS1. Проверяя его точность, была применена технология для изучения роли сотен плохо охарактеризованных smORFs. Насколько известно, данные SGS1 по удалению плитки представляют собой первое комплексное разрушение эукариотического белка в домене, демонстрируя тем самым способность этой технологии быстро оттачивать критические области, необходимые для функционирования белка. Многие использовали традиционные методы для выделения специфических генов 140 smORFs -мутантов.
Напротив, некоторые продемонстрировали простоту такого метода гид+донор, быстро охватив ~777% из 299 предполагаемых smORFs в геноме дрожжей, многие из которых ранее были проигнорированы.
Важно отметить, что эта способность захватывать наиболее известные хиты, выявленные в разных работах, установила специфичность и чувствительность нашей платформы при систематическом исследовании функции генов. Учитывая степень сохранности между геномами дрожжей и человека, а также между несколькими smORFs и более высокими эукариотами, было бы интересно посмотреть, обладают ли SmORFs, идентифицированные в такой работе с ролью в стрессоустойчивости, аналогичными функциями у человека.