Время хранения и условия хранения
Деградация ДНК в образцах насекомых происходит с течением времени, в зависимости от метода сохранения. Однако было показано, что при использовании консервантов, смешанных с водой (например, 70% этанола) и медленно поступающих в ткани (например, раствор Карноя и метанол), результаты экстракции ДНК хуже, чем при отсутствии консерванта.
Действительно, неправильные фиксаторы вызывают срез ДНК в течение нескольких дней, что делает невозможным использование образцов для биомолекулярного анализа. Напротив, для анализа ДНК могут использоваться высушенные, заколотые насекомые, не подверженные воздействию фиксирующих веществ, хотя процент успешных образцов после извлечения ДНК и ПЦР достаточно переменчив.
Основная проблема с высушенными, прижатыми насекомыми заключается в том, что невозможно заранее узнать, смогут ли образцы предоставить молекулярные данные, что затрудняет оценку баланса между повреждением образца и добавленной стоимостью. Выбор правильного фиксирующего решения может гарантировать кураторам музея возможность получения результатов после отбора проб.
В любом случае, время хранения оказало значительное влияние на длительность последовательности, которая может быть усилена ПЦР, так что увеличение возраста образца соответствует уменьшению длины ампликонов.
Однако даже спустя годы можно усиливать относительно короткие фрагменты (около 600 700 пар оснований), что позволяет, например, использовать собранные насекомые для проектов ДНК штрих-кодирования.
Разрушительное или полуразрушительное управление образцами
Извлечение ДНК является разрушительным для анализируемых образцов, и отбор образцов может нанести ущерб всему организму насекомого.
Это необратимое повреждение образцов побуждает кураторов музея рассматривать молекулярные методы как непривлекательные для редких и важных образцов (например, типовые образцы и редкие или вымершие насекомые) (Gilbert et al. 2007; Payne and Sorenson 2003).
Для преодоления этих ограничений были разработаны полупрозрачные методы извлечения ДНК с минимальным видимым внешним морфологическим повреждением образцов.
Полуразрушительные методы могут использовать части насекомых для выделения достаточного количества ДНК для молекулярных анализов, например, от трех до пяти миллиметров (мм) длинной части одной или двух ног.
Этот подход довольно часто применялся к диптерам, гименоптериям и лепидоптериям, и ДНК может быть извлечена с помощью ног одной стороны, при этом взрослое животное хранится в музее в качестве образца ваучеров.
Ноги особенно полезны в Лепидоптериях, так как бабочки держат в энтомологических шкафах с ногами под телом, чтобы не было сразу видно, были ли вскрыты образцы.
Недавно для Coleoptera был разработан очень интересный метод химического отбора проб ДНК из высушенных музейных образцов без нанесения внешнего морфологического ущерба.
В частности, весь жук погружается в экстракционный буфер, который переваривает мягкие внутренние ткани, оставляя экзоскелет неизменным. Изученные насекомые могут быть последовательно сохранены в энтомологических шкафах для дальнейшего изучения.
Аналогичная химическая экстракция ДНК была успешно применена к различным наземным членистоногим и, в частности, к образцам, принадлежащим к группе Acarina (клещи и клещи), Araneae (пауки), Coleoptera, Diptera и Hymenoptera, выбранным для представления диапазонов размеров, общей склеротизации и деликатности ключевых морфологических признаков.
Наличие успешных и простых в применении методов полуразрушающего отбора образцов ДНК очень важно, поскольку они позволяют проводить молекулярный анализ и сохранять морфологические ваучеры на последовательности.
Действительно, важно убедиться, что каждая последовательность ДНК связана с ваучером на оригинальный образец. Если реальных образцов нет в наличии, может оказаться полезным сфотографировать отличительные особенности образцов.
В связи с этим следует отметить, что молекулярные исследования могут быть очень полезны для определения неправильной идентификации образцов, которая может быть последовательно подтверждена музейными систематиками.
Появление ваучера на каждую последовательность настолько важно, что оно должно представлять собой обязательное условие для всех опубликованных результатов, основанных на последовательностях.
Важность ваучера связана с повторяемостью полученных последовательностей и доступом к оригинальным образцам для повторного изучения с целью решения вопросов идентификации видов, филогении и эволюции.
Наличие полуразрушающих методов позволяет сочетать молекулярные данные со специфическими морфологическими особенностями исследуемых образцов, связывать молекулярные базы с морфологическими данными. Ведение таких баз данных будет необходимо и важно.
Например, если насекомое использовалось для извлечения ДНК, его можно было бы назвать "использованным для извлечения ДНК". Аналогичным образом, если ноги были взяты у насекомого, на этикетке могут быть указаны "ноги, удаленные для извлечения ДНК".
Выводы
В последние десятилетия все большее число молекулярных исследований проводилось с использованием насекомых из музейных коллекций.
Однако доступность образцов была ограничена разрушительным характером процедур извлечения ДНК, которые создают конфликт между исследованиями ДНК и архивным хранением коллекций.
Тем не менее, недавно опубликованные исследования предлагают дешевые и применимые методы улучшения сохранения насекомых для молекулярных исследований.
В то же время были предложены новые и менее разрушительные методы извлечения ДНК, сочетающие в себе сохранение образцов и извлечение ДНК. Эти нововведения повышают приоритет необходимости в широко применимых кураторских и исследовательских рекомендациях для молекулярных анализов музейных коллекций.