Сахарный диабет является одним из основных факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, который является основной причиной смертности и связан с плохими клиническими результатами. Среди факторов, связанных с сердечно-сосудистыми осложнениями сахарного диабета, в стенке артерии накапливаются конечные продукты углубленного гликирования, полученные в результате неферментативного гликирования белков, где они могут нарушать структуру и функцию клеток. АПЭ были вовлечены как в микрососудистые, так и в сосудистые осложнения диабета. Кроме того, АПЭ способствуют развитию воспаления и окислительного стресса через несколько соответствующих рецепторов, главным из которых является рецептор АПЭ. В отличие от других рецепторов, RAGE экспрессируется со своими лигандами в тканях.
Хорошо известно, что гладкомышечные клетки сосудов играют решающую роль в посредничестве вазомоторной функции. Предыдущие исследования показали, что калийные каналы с гальваническим покрытием в ВСМК участвуют в регулировании мембранного потенциала и вазомирования. Эти каналы имеют гетеротетрамерное строение в различных сосудистых кроватях, включая аорту, легочные артерии, церебральные артерии, брыжеечные артерии. Высокие концентрации глюкозы или АПЭ нарушают работу каналов Kv1.2 и Kv1.5 в коронарных мышечных клетках гладких артерий и коронарных артериях крыс путем снижения активности каналов Кв. H2O2-индуцированное расширение жировых артериол человека нарушается при ишемической болезни коронарных артерий.
Материалы и методы
1. Эхокардиография и измерение артериального давления
Для функционального и морфометрического анализа крысы ZL и ZDF подвергались анестезии изофлураном. Эхокардиографию проводил наблюдатель, ослепленный от групп с помощью линейного преобразователя частоты 50-60 МГц с системой формирования изображений высокого разрешения Vevo 770 T M.
2. Измерение изометрических сил в изолированных малых коронарных артериях
Крыс обезболивали внутрибрюшинным введением хлоральгидрата. Под анестезией сердце каждой крысы было осторожно извлечено и помещено в ледяной раствор ГЭС. Затем левую переднюю нисходящую артерию разрезали на 2-мм кольца диаметром от 150 до 200 мкм. Решение HEPES включало следующее: 8,415 г/л NaCl, 0,432 г/л KCl, 0,244 г/л MgCl2-6H2O, 0,277 г/л CaCl2, 2 г/л глюкозы и 1,1915 г/л ГЭС. Эндотелий был денудирован сухим воздухом, введенным через стеклянную канюлю, соединенную со шприцем объемом 1 мл, и эффективность эндотелиальной денудации была подтверждена.
3. Ферментативная изоляция CSMCs
CSMCs ферментативно отделялись от артерий. Сегменты коронарных артерий 20-летнего самца крыс Sprague Dawley были разрезаны на небольшие кольца, а эндотелий был денудирован сухим воздухом.
4. Протокол и условия клеточной культуры клеток
Первичные ферментативно диссоциированные CSMCs выращивались в модифицированной среде орла Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота, 100 U/mL пенициллина G и 100 мг/мл стрептомицина при 37 °C и 5% CO2. CSMCs были субкультурированы на новые культурные плиты, когда они достигли 90% слияния.
Для исследования влияния АПЭ на работу канала КВ, ЦСМЦ подвергались воздействию 100 мкг/мл АПЭ-БСА в течение 24 ч. АПЭ-БСА был приобретен у Abcam. Уровень эндотоксина AGE-BSA, который определялся кинетическим турбидиметрическим набором лизата тахиплеуса амебоцитов, был <0,100 Eu/μg, что свидетельствует об отсутствии очевидной эндотоксинной инфекции. ALA при 100 мкМ использовалась в качестве сшивателя AGE.
5. Иммуногистохимия
Свежеизолированные сегменты коронарных артерий фиксировали 4% параформальдегидом, вставляли в парафин, а затем разрезали на 5-микрометровые сечения. Секции исследовали первичными антителами против RAGE, актином α-гладкой мышцы и 3-нитротирозином; в качестве вторичных антител использовали биотинилированный IgG-кролика коз.
6. Определение ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ИФА) АПЭ, маркеров окислительного стресса и цитокинов воспалительного действия
Для выявления и количественной оценки фактора некроза опухоли α, интерлейкина 1, интерлейкина 1, интерлейкина 6, супероксиддисмутазы, пероксидазы глутатиона и малондиальдегида были отобраны образцы клеточных супернатантов и сыворотки крыс.
АПЭ снижают экспрессию белка квантового канала в ЦСМЗ
Для обеспечения однородности изолированной популяции и минимального заражения другими типами клеток проводили анализ культивированных клеток иммунофлюоресцентным окрашиванием. После инкубации с поликлональным антиα-SMA антителом кролика и биотинилированным вторичным антителом козы культивируемые клетки получили положительную маркировку SABC-FITC, поэтому успешно изолировали и культивировали однородные и однородные клетки гладкой мышцы.
Клетки инкубировали с различными концентрациями AGE-BSA в течение 24 ч или 100 мкг/мл AGE-BSA в течение различных периодов времени. По сравнению с заготовкой и контролем БСА обработка препаратом AGE-BSA значительно снижает пролиферацию клеток в зависимости от концентрации и времени.