Некоторые женщины испытывают проблемы со здоровьем во время беременности. Эти осложнения могут быть связаны со здоровьем матери, плода или и того, и другого. Даже женщины, которые были здоровы до беременности, могут испытывать осложнения. Осложнения беременности, такие как гипертонические заболевания, такие как преэклампсия и нарушения обмена веществ, такие как гестационный диабет, являются синдромом беременности и основной причиной материнской, фетальной и неонатальной заболеваемости и смертности.
Во время беременности плацента имеет решающее значение для эмбрионального и эмбрионального развития, которое может переносить питательные вещества, дыхательные газы и воду из материнской ткани в растущий эмбрион, а в некоторых случаях и для удаления отходов из эмбриона. Плацентарные процессы включают инвазию трофобластов, васкуляризацию трофобласта для установления и поддержания фетоплацентарной сосудистой системы и последующую реконструкцию сосудов матери до васкулатуры, а также последующую сосудистую перестройку матери для достижения внутриутробно-плацентарной циркуляции. При синхронизированном развитии компетентных и экстравиллянтных трофобластических клеток плаценты для этого процесса крайне важно. ЭВТ является важным компонентом эмбриона.
Материалы и методы
1. Объекты исследования и сбор образцов
У некоторых контрольных женщин в анамнезе не было серьезных заболеваний, осложнений, связанных с беременностью. Предэкламптические беременности определялись началом гипертензии во время беременности и постоянной протеинурией. Женщины с ГРМ, диагностированные с помощью теста на толерантность к оральному глюкозе в течение 24-28 недель беременности. Плаценты получали от здоровых беременных женщин или беременных с ПЭ и ГДМ сразу после родов, замораживали и держали в жидком азоте до выделения РНК.
2. Анализ клеточного апоптоза
После HTR-8/Svneo клетки трансфецировались si-PVT1/si-NC или pcDNA3.1-PVT1/pcDNA3.1 и собирались для анализа апоптоза клеток. Для анализа клеточного апоптоза клетки обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя комплекта для обнаружения апоптоза пропидия V-FITC/Propidium Iodide. Анализ кювет проводился проточным цитометром Accuri C6 или FACScaliber, а анализ данных проводился с помощью программного обеспечения FlowJo. Для дальнейшего сравнения учитывалось относительное соотношение ранних и поздних апоптотических клеток.
3. Анализ на царапины в пробирке
Анализ царапин на ранах использовался для оценки миграционной способности клетки HTR-8/Svneo. Примерно 2 × 106 клеток были семенами на 6-луночную посуду и культивировались в растительной среде в течение 24 ч до слияния примерно 70-80%. Эти клетки трансфецировали si-PVT1/si-NC или pcDNA3.1-PVT1/pcDNA3.1 в течение 24 ч. После 24 ч. трансфекции была сделана вертикальная горизонтальная рана стерильным наконечником 200 мкл дозатора. Каждую лунку промывали дважды 1 мл свежей растительной среды для удаления отдельных клеток, затем культивировали в инкубаторе при температуре 37 °C.
4. Трансвелловые анализы
Миграция клеток и инвазивная способность оценивались с помощью трансвелловых анализов. После 48 часов инкубации остаточные клетки на верхней поверхности камеры были полностью удалены, а те клетки, которые пересекали мембрану, были зафиксированы и окрашены. Для количественной оценки миграции и инвазивности клеток мы подсчитали количество мигрирующих и вторгающихся клеток в пяти случайных полях зрения для каждой камеры с помощью цифровой микроскопии и вычислили среднее значение.
5. Извлечение РНК и количественная цепная полимеразная реакция в реальном времени
Полная РНК была извлечена из клеток HTR-8/Svneo или плаценты, а затем обратная транскрибирована в кДНК. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа использовалась в качестве эндогенного контроля для нормализации данных qPCR.
6. Ядерная и хроматиновая фракции РНК
Ядерные и цитоплазматические фракции клеток HTR-8/Svneo были разделены. Всего было собрано 107 свежих культивированных ячеек, помещенных на лед и повторно взвешенных с 500-ул фракционирующим буфером ледяных клеток. Клетки выдерживали на льду в течение 15 минут. Образцы центрифугировали при 500 г в течение 5 минут, после чего цитоплазматическую фракцию тщательно всасывали в новую пробирку из ядерных гранул. Выделение РНК из хроматина и нуклеоплазмы проводили в соответствии с протоколом производителя.
Более высокая экспрессия PVT1 в клетках HTR-8/Svneo по сравнению с другими раковыми клетками
Для определения дифференциальной экспрессии PVT1 в клетках HTR-8/Svneo мы количественно определили экспрессию PVT1 с помощью qRT-PCR в ряде различных клеток, таких как HTR-8/Svneo, эндотелиальные клетки пуповины человека, раковые клетки груди, клетки яичников и раковые клетки поджелудочной железы. Результаты показали, что экспрессия PVT1 наиболее выражена в клетках HTR-8/Svneo. Две наиболее изученные клетки плаценты в основном трофобластные и HUVEC, а уровень экспрессии PVT1 в клетках HTR-8/Svneo также был выше, чем в клетках HUVEC.