Острая миелоидная лейкемия, хронический миелоидный лейкемия, острый лимфоцитарный лейкемия и хронический лимфоцитарный лейкемия - четыре основные категории лейкемии, рак крови или костного мозга. ВСЕ - злокачественные новообразования крови предшественников лимфоидов, включая лимфобласты, незрелые В- и/или Т-клетки, с неконтролируемой пролиферацией. Среди ВСЕХ случаев острый В-клеточный лимфоцитарный лейкоз является наиболее распространенной формой ВСЕГО, составляя около 85% случаев ВСЕХ детей и около 75% случаев ВСЕХ взрослых. Т-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз является второй по распространенности причиной ВСЕГО заболевания, на долю которого приходится около 15% ВСЕХ случаев заболевания в детстве и около 25% ВСЕХ случаев заболевания у взрослых. В настоящее время около 90% случаев лечения ВСЕХ детей и подростков делает лечение ВСЕХ наиболее успешным. Однако генетика лейкемии высокого риска, несоблюдение режима лечения, нетерпимость к химиотерапии и отсутствие взрослых онкологов, имеющих опыт лечения ВСЕГДА, заставляют ВСЕХ взрослых пациентов испытывать низкую выживаемость - менее 40%. Поэтому важно определить высокочувствительные диагностические и прогностические маркеры для лечения ВСЕХ заболеваний.
Благодаря широкому применению микрочипов с микрочипами, особенно генных, был создан большой объем данных, обеспечивающих высокую производительность для генных исследований, а база данных GEO в настоящее время является крупнейшим и наиболее полным международным ресурсом данных по экспрессии публичных генов. В настоящее время база данных ГЕО содержит многочисленные серии данных и образцы индивидуальной экспрессии генов.
Методы и материалы
1. Клинические образцы
В период с 2017 по 2018 год в Шэнкинской больнице Китайского медицинского университета в Китае 20 пациентов с Т-клеточным острым лимфобластным лейкемией и 20 пациентов с В-клеточным острым лимфобластным лейкемией были собраны лимфоцитами периферической крови. Все лимфоциты периферической крови всех пациентов были обработаны для гистологического исследования.
2. Количественная обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (qRT-PCR)
Для RT-PCR 1000 нг общей РНК транскрибировалось непосредственно обратно с помощью PrimeScript RT Master Mix и случайных праймеров. Анализ ПЦР в режиме реального времени проводился с использованием комплекта SYBR® Premix Ex Taq™ для количественной оценки мРНК. В качестве внутреннего контроля использовался ГАПДГ. Все экспериментальные операции проводились с использованием системы Thermal Cycler Dice™ Real Time TP800. Для расчета относительной экспрессии каждого гена использовался метод ΔCT.
Анализ западного пятна
Для извлечения общего белка в центрифугированные клетки был добавлен буфер RIPA. Общий белок денатурировали и отделяли 10% додецилсульфатополиакриламид натрия электрофорезным гелем. Для переноса белка в течение 2 ч использовали мембраны из поливинилиденфторида, а мембраны блокировали на 1 ч. Затем все мембраны инкубировали с анти-CL5, анти-FSCN1, антиHS3ST1 и анти-GAPDH, первичными анти-GAPDH, Sanru. Трисбуферный физраствор/Tween-20 использовался для промывки мембран три раза, а затем все мембраны инкубировали с вторичными антителами.
Анализ на включение этинила-20-деоксиуридина (EdU)
После трансфекции в течение 48 ч в общей сложности 5 × 103 клетки на колодец были покрыты 96-луночными планшетами. Затем к 96-луночным планшетам было добавлено 50 мкм мол/л EdU в течение 4 часов при 37 °C в 5 % инкубаторе CO2. Клетки обрабатывали 4% формальдегидом в течение 15 мин и 0,5% Тритоном Х-100 в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем все камеры были обработаны в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ на апоптоз
Апоптоз во всех клетках определялся проточной цитометрией в соответствии с инструкциями производителя. Оцененные на апоптоз клетки инкубировали в темноте при комнатной температуре с добавлением 5 мкл V-FITC и 5 мкл пропидия йодида.
Анализ микромассива экспрессии генов ВСЕХ и неходжкинцев с помощью микромассива гена
Анализ выявил 2809 дифференциально экспрессированных генов с изменением складки >2 и значением p ≤0,05. Затем мы использовали набор данных GEO GSE20011 для идентификации ДЭГ между клеточной лимфобластной линией и клеточной линией неходжкинской. Всего было найдено 3034 DEG с изменением складки > 2 и значением p ≤ 0,05. Дифференциальный генный анализ исходных данных микросхем проводился с помощью инструмента анализа языка R с сайта GCBI. Тепловые карты были использованы для визуализации распределения экспрессированных генов между двумя группами. Кроме того, двунаправленная диаграмма Венна выявила 1545 ДЭГ. Исследования биологических процессов и сигнальных путей помогут нам понять роль генов во ВСЕХ и глубже понять патологические процессы или патогенез ВСЕХ. Затем ГДЭ были подвергнуты анализу путем GO и KEGG для определения соответствующих биологических процессов и сигнальных путей, соответственно.