Вид реактивного кислорода - это общий термин, относящийся к химическим видам, которые образуются в результате неполного восстановления молекулярного кислорода, таким как анион супероксида, перекись водорода и гидроксилрадикал. Они постоянно вырабатываются ферментативным и неферментативным метаболизмом в клетках. Низкие уровни ROS обратимо окисляют белковые тиоловые группы и действуют как клеточные сигнализаторы, в то время как высокие уровни ROS наносят ущерб фундаментальным клеточным процессам неспецифическими атакующими белками, липидами и ДНК. Для снижения окислительного стресса, вызываемого РОС, клетки млекопитающих разработали систему антиоксидантной защиты, которая состоит из антиоксидантных ферментов, а также нескольких неферментативных антиоксидантов, таких как глутатион, цистеин, тиоредоксин и витамины.
Глутатион S-трансферазы - это семейство ферментов детоксикации фазы II, катализирующих спряжение ГСГ к широкому спряжению эндогенных и экзогенных электрофильных соединений. GSTs делятся на три основные категории: цитозолические, митохондриальные и мембранно-связанные микросомальные GSTs. Нулевой фенотип GSTM1 повышает риск развития рака печени, желудка, молочной железы и простаты. Более того, в предыдущих исследованиях сообщалось об ассоциации нулевого генотипа GSTM1 с исходом терапии рака.
Материалы и методы
1. Анализ экспрессии генов
Получена суммарная РНК с помощью TRIzol. Для обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции 1 мг общей РНК было обратно транскрибировано с помощью комплекта синтеза кДНК первой нити RevertAid.
2. Анализ Всемирного банка
Ткани и клетки были лизированы в радиоиммунопреципитационном буфере лизиса. Одинаковые количества белков выделяли с помощью 10%-15% додецилсульфат-полиакриламид натрия электрофореза и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После инкубации с антителами, специфичными для GSTM1, P53, Комплект для отбора проб антител апоптоза и актина, Кляксы инкубировали пероксидазой хрена (HRP)-связанной с мышью или вторичными антикроликовыми антителами и выявляли с повышенной хемилюминесценцией.
3. Плазменная конструкция и сиРНК
Кодировка кДНК GSTM1, TP53 или TP53 была усилена ПЦР с помощью полимеразы Taq и клонирована в сайт TaqBamHI/XhoI pcDNA3.1(+).
4. Культура клеточных линий и лечение
Все клетки культивировались в Dulbecco's Modified Eagle Medium, которая содержит 10% фетальной говяжьей сыворотки, при 37 °C в 5% CO2 и субкультурируется каждые 2-3 дня. Клетки были посеяны на шести лунках плотностью 3 × 105/лунок или двенадцати лунок плотностью 1 × 105/лунок. Трансфицированные клетки собирали в течение 48-72 ч. Для анализа на апоптоз в течение 24 ч перед добавлением доксорубицина.
5. Анализ распределения апоптоза и клеточных циклов
Для флуоресцентной сортировки клеток при анализе апоптоза и клеточного цикла проводился сбор адгезивных и плавающих клеток по методике KGA107 и KGA511-KGA512 для определения клеточного цикла KeyGEN.
6. Анализ миграции
Клетки были посеяны в 1% фетальной говяжьей сыворотке на 24-х луночных вставках из полиэтилена терефталата. В нижнюю камеру заливали 700 мкл сывороточной среды по 20%. Через 24 часа клетки, прошедшие через фильтр, фиксировались в 4% формальдегиде, окрашивались фиолетовым кристаллом 0,05%.
7. Анализ опухолей на предмет происхождения и метастаза в естественных условиях
Для ксенотрансплантатов устойчивая клеточная линия клеток СММК-7721 приостанавливалась в 100 мкл фосфатбуферного физраствора и вводилась в нижнюю часть тела обнаженных мышей 4-6 недельней жизни. NC-клетки SMMC-7721 были введены в нижний фланг того же обнажённого мышонка с противоположным боком. Через 3-4 недели опухоли были удалены с обнаженных мышей и сфотографированы. Диаметр опухоли измеряли с помощью суппортов, а объем опухоли в мм3 рассчитывали по следующей формуле: Объем = (ширина)2 × длина/2. Устойчивые клеточные линии клеток MHCC-97H подвешивались в 100 мкл PBS и вводились в хвостовую вену мыши.
8. Анализ GSH
Лизаты клеток были собраны и использованы в наборе для анализа GSH. Различные концентрации стандарта GSH, входящего в комплект, были окрашены реагентами 2 и 3 в течение 5 минут при комнатной температуре и поглощение измерялось на 405 нм с помощью считывателя микропластин для построения стандартной кривой.
GSTM1 дерегулирован в ГЦК и связан с метастатическими фенотипами
Используя ГАПДГ в качестве средства контроля, GSTM1 подвергался значительному снижению регуляции в 66,7% онкологических тканей по сравнению с соответствующими соседними нормальными тканями. Средние уровни экспрессии мРНК и белка GSTM1 в ГЦК были значительно ниже, чем в соседних тканях. Уровни экспрессии GSTM1 были в значительной степени связаны с тромбомбомбом воротной вены. Однако анализ выживаемости Каплана-Мейера показал, что уровень экспрессии мРНК GSTM1 не связан с общим временем выживания больных ГЦК, n = 361. Кроме того, проанализировали данные о раке в базе данных Oncomine microarray, которые показали, что GSTM1 снижает регуляцию при раке груди.