Среди факторов, связанных со старением кожи, генетические и физиологические факторы составляют лишь около 3%, а факторы окружающей среды - 97%. Существует три вида ультрафиолетовых лучей в солнечном свете: длинноволновой УФА, средневолновой УФБ и коротковолновой УФК. Почти весь УФХ поглощается озоновым слоем и биологическая активность УФА значительно ниже, чем у УФБ, поэтому УФБ считается основной причиной фотостарения. Когда интенсивность УФ-облучения превышает 3,7 мДж/см2 в день, окислительно-гомеостаз кожи может быть разрушен, за ним следует перекисное окисление липидов клеточных мембран, выделение лактатной дегидрогеназы и снижение уровня ферментативных антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза и каталаза и антиоксант. Когда кожа подвергается воздействию чрезмерного ультрафиолетового излучения, происходит связанное с этим накопление активных видов кислорода и нарушение равновесия в системе окисления и антиоксидантов, что приводит к окислительному стрессу.
Долгосрочное облучение также повлияло на развитие уникальной и эффективной антиоксидантной системы защиты кожи у земноводных для борьбы с окислительным стрессом. Защиту кожи антиоксидантами можно разделить на три категории: 1) высокомолекулярные генно-кодирующие ферменты, состоящие из СОД; 2) негенетически закодированные антиоксиданты низкой молекулярной массы, состоящие из витамина С или эндогенных антиоксидантов, таких как восстановленный глутатион и убиквитин-10; и 3) небольшие молекулярные пептиды, закодированные генами. Эти антиоксидантные системы защиты кожи способны быстро вырабатывать антиоксидантные пептиды, поглощающие свободные радикалы для снижения окислительного воздействия на кожу.
Материал и методы
1. Влияние ОА-VI12 на жизнеспособность клеток HaCaT, облученных ультрафиолетовым излучением
HaCaT клетки трижды промывали фосфатным буферным раствором для отделения отмерших клеток, а затем делили на три группы. Затем клетки были посеяны в 96 лунках, содержащих 90 мкл DMEM/F12. После воздействия лампы 9 W/01 UVB клетки в группе образцов подвергались предварительной обработке с различными концентрациями ОА-VI12 или 10 мкМ VC при 37 °C в течение 2 ч. После этого в инкубированные клетки добавляли 20 мкл МТС в течение еще 2-4 ч для проверки влияния OA-VI12 или VC на жизнеспособность HaCaT клеток.
2. Влияние ОА-VI12 на жизнеспособность клеток HaCaT, обработанных H2O2
Ячейки были сгруппированы и посеяны на пластинах в соответствии с вышеуказанными методами. Затем клетки обрабатывали 200 мкМ H2O2 в течение 2 ч после предварительной обработки различными концентрациями OA-VI12 или VC при 37 °C в течение 2 ч.
3. Воздействие ОА-VI12 на уровни РОС в клетках HaCaT, облученных H2O2 или УФБ-облучением
Клетки были разделены на четыре группы и посеяны в 6 лунках. Затем клетки обрабатывали H2O2 в течение 2 ч или облучали УФБ после предварительной обработки различными концентрациями OA-VI12 или VC при 37 °C в течение 2 ч. Через 2 ч клетки повторно суспендировали в нагретой PBS, содержащей 1 мкМ H2DCFDA флуоресцентного зонда при 37 °C в течение 45 минут.
4. Воздействие ОА-VI12 на уровни КАТ и ЛДГ в клетках HaCaT, облученных H2O2 или УФБ-облучением
Клетки HaCaT трижды промывали PBS, затем переваривали 0,25% трипсином в течение 4 минут, центрифугировали при 1000 г в течение 5 минут при 37 °C, подвешивали в 0,5 мл холодного PBS, тушили в морозилке, а затем нарушали ультразвуковой распылитель. Разрушающие смеси клеток центрифугировались при 12 000 г в течение 15 минут при температуре 4 °C.
5. Гематоксилин и эозини трихромное окрашивание кожи мыши, облученной ультрафиолетовым излучением
Образцы тканей мыши фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 ч, затем обезвоживали и гиалинизировали по результатам предыдущего исследования. Для гистологического анализа образцы тканей были разделены на кусочки толщиной 6 мкм и окрашены H&E.
6. Измерение содержания СОД и GSH в коже мыши, облученной ультрафиолетовым излучением
Образцы тканей мыши гомогенизировались в течение 3 минут в 1 мл холодного PBS, затем центрифугировались при 10 000 г в течение 15 минут при 4 °C. Супернатанты были собраны для измерения содержания СОД и GSH.
Результаты
1. Химическая структура и прогнозирование перспективной структуры ОА-VI12
Молекулярная формула ОА-VI12 - "VIPFLACRPLGL", а ее химическая формула - C62H103N15O13S. Прогнозируемая усовершенствованная структура, отображенная на двух картах спереди и сбоку, состояла в основном из α-спираликса и остатка боковой цепи.
2. Предварительная обработка с помощью OA-VI12, поддерживающая жизнеспособность клеток HaCaT против УФ-облучения и обработки H2O2
ОА-VI12 не оказало очевидного влияния на жизнеспособность клеток HaCaT. Жизнеспособность клеток HaCaT значительно снизилась при облучении УФБ или H2O2, однако предварительная обработка ОА-VI12 защитила клетки HaCaT от снижения жизнеспособности, вызванного как УФ-облучением, так и H2O2. В группе предварительной обработки ОА-VI12 жизнеспособность клеток была такой же, как и в группе VC.