Во всем мире ежегодно потребляется большое количество энергии и химических веществ, получаемых из ископаемых источников. Более того, массивное сжигание мазута также привело к увеличению выбросов CO2, что привело к парниковому эффекту и последующему глобальному потеплению. С другой стороны, альтернативные источники энергии привлекли большое внимание не только для защиты окружающей среды, но и для удовлетворения различных потребностей энергетического рынка. Биоэтанол является одним из таких возобновляемых источников энергии, производство которого с использованием микробной ферментации развивается вместо бензина. Из всех микроорганизмов дрожжи являются наиболее распространенными производителями этанола и широко используются в топливной промышленности этанола. С термодинамической точки зрения, высокотемпературная ферментация этанола дает ряд преимуществ, таких как снижение риска загрязнения нежелательными микроорганизмами, снижение затрат на охлаждение биореакторов и повышение производительности этанола. Благодаря своей устойчивости к высоким концентрациям этанола и токсичным веществам, образующимся в процессе ферментации, дрожжи оказались более практичными для производства этанола, чем бактерии.
Дрожжи широко распространены в природе с различными экосистемами, и многие исследователи пытаются изолировать эти организмы от различных экологических ниш, таких как почва на плантациях сахарного тростника, маниоки и ананасов, гнилых фруктов или естественных ферментированных источников, а также гнили. Несколько видов дрожжей, выделенных из естественных местообитаний, были классифицированы как промышленные термоустойчивые дрожжи. Сахарный тростник, одна из самых богатых сельскохозяйственных экосистем Таиланда, является перспективным районом, предлагающим одни из лучших микробных сообществ, предпочитающих выращивать дрожжи, вырабатывающие этанол. Почва получает все или большую часть питательных веществ из внешних источников; поэтому почва является настоящей средой обитания для ряда видов дрожжей. Природные экосистемы являются основным источником полезных микроорганизмов для производства биозаводов.
Взятие проб и изоляция проб
Пробы почвы с полей сахарного тростника были отобраны в провинциях Уттарадит, Камфаэн-Пхет, Чай-Нат, Сухотай, Нахон Саван и Фицанулок, Таиланд. Изоляция проводилась методом обогащения дрожжевым декстрозой с добавлением 4% этанола, 0,025% пропионата натрия и 0,02% хлорамфеникола, США и др. Два грамма образца почвы были добавлены к 50 мл бульона YPD, содержащего антибиотики и 4% концентрации этанола, и выдерживались при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем, обогащение культуры разводили на агаровой пластинке YPD и инкубировали при 37 °C до появления одной колонии. Все чистые культуры собирались и хранились на агаре YPD при температуре 4 °C для кратковременного хранения.
Изучение термоустойчивости и толерантности дрожжей к этанолу
Дрожжевые изоляты предварительно культивировались в бульоне YPD при 30 °C, затем прививались в свежий бульон YPD, пока рост не достиг ранней стационарной фазы. Характеристики роста каждого дрожжевого изолята при высокой температуре были проверены модифицированным методом, описанным Юангсаардом и др. и Техапариным и др.
Испытание ферментационной активности термоустойчивых дрожжей при высоких температурах
Первоначально дрожжевые изоляты испытывались на производство этанола при 37 °C, 40 °C, 42 °C и 45 °C в бульоне YPD. Скрининг ферментации этанола проводили с помощью ферментационной трубки Дарема с 0,1 мл активных клеток, привитых в бульон YPD в пробирке, содержащей трубку Дарема, а затем статически инкубировали при различных температурах.
Оценка производства этанола
Для количественной оценки производства этанола с помощью газохроматографического анализа дрожжевые клетки были предварительно аэробно обработаны до экспоненциальной фазы в бульоне YPD при 30 °C, а затем привиты в колбу 250 мл Эрленмайера, содержащую 100 мл свежей среды YPD бульона с 16% глюкозы в качестве источника углерода. Исходное значение оптической плотности клеток перед дальнейшим культивированием составляло 0,1, и инкубация происходила при определенных температурах в инкубаторе со скоростью 135 об/мин. Часть бродильного бульона была изъята из каждой колбы после 24-часовой, 36-часовой и 48-часовой инкубации и центрифугирована на 16.200✕g в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант был собран и подвергнут газовой хроматографии с целью измерения концентрации этанола.
Скрининг термоустойчивых дрожжей на содержание этанола и термоустойчивых дрожжей
В общей сложности 60 изолятов дрожжей были получены с использованием обогатительной культуры YPD бульона и пахоты на агаре YPD при 37 °C
Кроме того, все 30 изолятов можно было выращивать на агаре YPD, содержащем 7% этанола. Из 30 изолятов 13 показали способность расти и на штамме YPD v/v, содержащем до 10% этил. Однако другие не могли переносить концентрации 10% этанола. Ни один из 30 изолятов не вырос при концентрации этанола 15%.