Атеросклероз является одной из основных причин сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт, в западном мире. Увеличение распространенности ожирения и сахарного диабета может объяснять увеличение смертности от ССЗ. Патогенез атеросклероза включает в себя взаимодействие компонентов кровотока и стенок артерий, что приводит к окислительному стрессу и воспалению сосудов. Хотя процессы, связанные с развитием атеросклероза, сложны, несколько линий свидетельств подтверждают роль воспаления и окислительного стресса при атеросклерозе. Прогрессирование поражений и жировых полос в результате сердечно-сосудистых воспалений может привести к острому инфаркту миокарда и инсульту.
Развитие ССЗ может быть связано с перепроизводством активных видов кислорода в патофизиологических условиях. Окислительный стресс является одним из основных факторов риска получения травм органов, ведущих к острым или хроническим заболеваниям. Кроме того, окислительный стресс может быть ключевым фактором дисфункции эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и адвентициальных клеток. В стенке атеросклеротического сосуда продемонстрировано повышенное образование РОС. Митохондриальная продукция РОС также может быть вовлечена в развитие атеросклеротического поражения.
Методы и материалы
1. Подготовка ГВДТ
Смесь трав извлекалась в 10 раз большей массой воды при 100°C в течение 2 ч с помощью электрического вытяжного устройства. Извлеченный раствор был сублимирован в порошок с помощью аппарата сублимированной сушки PVT100. Величина pH ГВДТ регулировалась в диапазоне от 6 до 8 с помощью триэтаноламина в качестве нейтрализатора. Анализ контроля качества CHWDT проводился ВЭЖХ.
2. Животные
Мыши выдерживались в специфических условиях, свободных от патогенов, при температуре 18-24°C, влажности воздуха 40-70%, светло-темном цикле 12 ч с доступом к пище и питьевой воде в либитуме. Для производства мышей с ожирением и атеросклерозом, вызванным диетическим питанием, 6-ти недельный Apoe-/-мыши получали питание с высоким содержанием жира или нормальный коровий рацион в течение 6 недель. В конце шести недель животным вводили ГВСДТ или транспортное средство каждые две недели в течение 6 дополнительных недель.
3. Клеточная культура
Клетки RAW 264.7 и U937 культивировались до слияния 75-80% в DMEM, содержащие 10% сыворотку крупного рогатого скота и 1% стрептомицин пенициллина в увлажненных инкубаторах при 37 °C с 5% содержанием CO2.
4. MTT-анализ
После достижения 70% слияния ячеек RAW 264,7 в 96-луночных пластинах, ячейки подвергались ГВСДТ в указанных концентрациях в течение 24 ч. Затем среду заменили средой, содержащей 1 мг/мл МТТ, в соответствии с указаниями производителя. Для количественной оценки жизнеспособности клеток МТТ-формазан элюировали изопропанолом.
5. Западная промокашка и ядерная фракционирование
Равное количество белков для всех образцов подвергали электрофорезу, а затем переносили на мембрану из поливинилидендифторида. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в PBS, содержащим 0,1% Твин 20 в течение 20 минут и инкубировались на ночь при 4 °C с первичными антителами, за которыми следовали вторичные антитела, сопряженные с пероксидазой хрена. Для обнаружения активации NF-κB ядерная фракция была извлечена из клетки с помощью ядерного/цитозольного комплекта фракционирования. Анализ ядерной фракции проводился методом иммуноблоттинга с использованием антител против β-актина в качестве цитозолического маркера и ламина А в качестве ядерного маркера.
6. Обратная транскрипция полимеразной цепной реакции
2 мг общей РНК было использовано для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV и праймера олиго 15. Полученную кДНК подвергали ПЦР для мыши GAPDH, 18S, SOD1, SOD2, каталазы, TNF-α и iNOS и человека GAPDH, SOD1, SOD2, каталазы, eNOS, TNF-α и iNOS. GAPDH и 18S были использованы в качестве внутреннего контроля загрузки для нормализации всех продуктов ПЦР.
7. Анализ аортального налета с окраской Судана IV и H/E
Аорты фиксировали перфузией, препарировали от их происхождения в сердце до бифуркации желудочков. Площади поперечного сечения кровеносных сосудов окрашивались гематоксилином и эозиновым раствором.
Влияние CHWDT на метаболические параметры в атеросклеротическом Apoe-/- мышах, индуцированных рационом питания с высоким содержанием жира
Атеросклероз вызывался при кормлении мышей Apoe-/- диеты с высоким содержанием жира в течение 6 недель. Масса тела ожиренных мышей была на 20% выше, чем у мышей, которых кормят нормальным кормовым рационом. Для изучения влияния ХВДТ на атеросклероз, вызванный ГРП, мышей на ГРП в течение 6 недель вводили орально с ХВДТ каждые две недели в течение еще 6 недель. Введение ГВДТ значительно снизило массу тела мышей HFD на 12 неделе. Атеросклеротические мыши значительно уменьшили содержание эпидидимального жира в жировой подушечке и подушечке околопочечников. Результаты показывают, что CHWDT дает антиатеросклеротический эффект, снижая вес тела и жировую прокладку, страдающих ожирением, вызванным HFD.