Молекулярная инженерия и синтетическая биология достигли той стадии, когда может быть сконструирован широкий спектр белков для распознавания и связывания практически с любой последовательностью ДНК. До сих пор эта способность использовалась главным образом для редактирования генома. Исследователи из Массачусетского технологического института, однако, разработали уникальное применение для этих конструируемых ДНК-связывающих белков: программирование их для обнаружения специфических последовательностей ДНК, таких как ДНК, связанная с патогеном, которое затем активирует индивидуальный клеточный ответ, такой как гибель клеток.
Исследовательская группа во главе с Джеймсом Коллинзом, профессором медицинской инженерии и науки Департамента биологической инженерии и Института медицинской инженерии и науки Массачусетского технологического института, а также научным сотрудником Шимином Сломовичем, опубликовала свои результаты в недавнем выпуске Nature Methods . «Можно сравнить ее с системой охранной сигнализации, которая оборудована для обеспечения безопасности контактов для интеллектуального реагирования при обнаружении злоумышленника», - утверждает Сломович.
Эта система обнаружения клеток использует тип ДНК-связывающего белка, известного как «цинковые пальцы», который можно запрограммировать на распознавание любой последовательности ДНК. Затем команда встроила ответ действия, вызванный событием распознавания.
Слева ячейки светятся красным, показывая, что система обнаружения была успешно доставлена. Система была разработана, чтобы производить зеленую флуоресценцию в клетках, несущих вирусную последовательность ДНК, как видно справа. Изображение: Шимин Сломович
Синтетические цинковые пальцы, полученные из белков млекопитающих, были объединены с интеиновыми белками, полученными из дрожжей (интеины - это короткие белки, которые можно вставить в более крупные белки, разделив их пополам). Части расщепленного белка становятся функциональными только после того, как интеин удаляет себя, позволяя двум частям соединиться вместе и сформировать функциональный белок, который затем активирует указанный ген. Флуоресцентный белок (GFP), полученный из медуз, был связан с распознаванием цинковыми пальцами последовательности ДНК из аденовируса; клетка, зараженная этим вирусом, будет светиться зеленым светом.
«В начале исследования мы представили платформу, которая была бы достаточно надежной для работы в клетке человека, но в то же время достаточно специфичной, чтобы различать мишень ДНК-патогена и нормальный геном, присутствующий в клетке», - говорит Сломович. «Было интересно достичь точки, в которой система могла бы идентифицировать и сообщать об инфекции живого реплицирующегося аденовируса внутри живых клеток».
Зараженные клетки также могут быть убиты. Система была запрограммирована на производство белков, которые предупреждают иммунные клетки о борьбе с инфекцией (вместо простой идентификации их с помощью GFP). Обнаружение ДНК-мишени было связано с увеличением производства фермента под названием NTR. Этот фермент активирует безвредный предшественник препарата под названием CB 1954, который исследователи добавили в чашку Петри, где росли клетки. При активации NTR CB 1954 убивает клетки.
«Поскольку это модульное решение, вы можете вызвать любой ответ, который захотите», - говорит Сломович. «Клетка может быть запрограммирована на то, чтобы убивать себя или секретировать белки, которые позволят иммунной системе идентифицировать ее как вражескую клетку, чтобы иммунная система могла позаботиться об этом».
Коллинз и Сломович в настоящее время адаптируют свои технологии для выявления латентных провирусов ВИЧ , которые остаются неактивными в некоторых инфицированных клетках даже после лечения.
«Латентный провирус ВИЧ является в значительной степени последним барьером для излечения СПИДа, который в настоящее время неизлечим просто потому, что последовательность провирусов существует, она неактивна, и нет никаких способов ее искоренения», - говорит Сломович. «Другое возможное использование этой системы будет помогать в создании клеточных линий, которые ученые разработали, чтобы содержать критические изменения генома, такие как устойчивость к ВИЧ-инфекции. Положительные клетки могут быть быстро идентифицированы, оптимизируя этот процесс. Мы также считаем, что платформу можно использовать для обнаружения вирусов на основе РНК или для диагностики в образцах пациентов ».
В ближайшей перспективе, однако, возможно, самое непосредственное использование системы будет в качестве диагностического инструмента, который позволяет исследователям проверять результаты экспериментов, которые пытаются генетически изменить типы клеточного материала. Еще одно применение будет держать биореакторы свободными от патогенов. «Многие важные терапевтические препараты и вакцины генерируются в больших биореакторах, в которых клетки млекопитающих культивируются для производства больших количеств», - добавляет Сломович. «Биореакторы чувствительны к патогенной инфекции, и система чувствительности и реагирования ДНК может помочь вооружить эти ценные клетки способами предотвращения или сдерживания таких инфекций».