Материалы и методы
Испытания проводились в теплице муниципалитета Лавра-МГ, расположенной в южной части штата Минас-Жерайс, на высоте 918 м над уровнем моря, 21°14' с.ш. и 45°00' с.ш., с декабря 2016 по март 2017 года. Среднегодовая температура воздуха составляет 19,4 °C, максимальная 26,1 °C и минимальная, 14.4 °C.
Для моделирования интоксикации саженцы кофе "Topázio MG1190" (Coffea arabica L.) были посажены в 11-L горшках с 4-5 парами листьев. Был использован рандомизированный блок с четырьмя репликами и четырьмя дозами гербицида глифосата: (i) 0%; (ii) 10%; (iii) 25% и (iv) 50% рекомендованной коммерческой дозы (3,0 Л га-1), применяемой непосредственно к кофейным растениям. Каждый участок состоял из трех растений.
Начало эксперимента
Применение гербицида в различных дозах осуществлялось с помощью прибрежного опрыскивателя CO2 под давлением, с давлением 45 фунтов, и бара распыления, направленного близко к верхней части растений, с объемом распыления 300 L.ha-1. После применения растения оставались в теплице в течение 104 дней, ежедневно орошались, с целью поддержания урожайности (100%). Медицинское обслуживание и культурный уход осуществлялись в соответствии с рекомендациями Матиэлло.
Визуальное наблюдение и визуализация симптомов, вызванных действием гербицида, осуществлялись ежедневно. Анатомические и физиологические оценки растений были проведены в конце эксперимента. Оценивались следующие характеристики роста: высота растения, измеренная в сантиметрах от уровня земли до апикального бутона ортотропной ветви; количество листьев; диаметр стебля, измеренный в миллиметрах у воротника растений; количество плагиотропных ветвей; площадь листа, измеренная в см², выраженная дисками листа; побеги, корни, плагиотропные ветви, ортотропные ветви и сухое вещество листа, в граммах. Анализ длины корня в сантиметрах определялся также суммой линейного расширения каждого фрагмента корневой системы и среднего диаметра корня в сантиметрах с помощью программного обеспечения Safira для визуализации.
Отслеживаемые характеристики
Для оценки анатомии листьев на 104 сутки были собраны листья, расположенные между вторым и третьим узлами плагиотропной ветви растений. Впоследствии в лаборатории были выполнены парадермические и поперечные разрезы. Парадокс был получен до сбора с использованием универсального моментального клея (цианакрилатный эфир). Для получения поперечных сечений растительный материал подвергался обезвоживанию этиловыми сериями, затем погружался в метакрилат (по методике производителя) и секционировался с толщиной 0,8 мкм с помощью вращающегося микротома. Впоследствии они были окрашены толуидиновым синим цветом, а лезвия были собраны с использованием Entelan® в качестве среды. Наблюдались и фотографировались под оптическим микроскопом, соединенным с цифровой камерой, слайды обоих разрезов (парадермический и поперечный). Полученные изображения анализировались в программе UTHSCSA-Imagetool, после чего проводилась оценка стоматальных характеристик, тканей листьев и сосудистых пучков.
Для стоматальной характеристики оценивались следующие характеристики: стоматальное число; диаметр полярной части стоматы и экваториальный диаметр стоматы. На основе этих данных были рассчитаны стоматальная плотность (количество стоматов на мм2 ) и отношение диаметр полярной зоны к экваториальному диаметру, которое тесно коррелирует со стоматальной функциональностью. Для оценки тканей листа измерялись: эпидермальная толщина адаксиальной поверхности; толщина палисадной паренхимы; толщина губчатой паренхимы; толщина мезофилла. При оценке сосудистых пучков измерялись следующие параметры: толщина флоемной области; диаметр ксилемных сосудов; и количество ксилемных сосудов.
Используемое оборудование
Для физиологического анализа использовалась переносная инфракрасная система анализа газов (LICOR - 6400XT) для оценки чистой скорости фотосинтеза (A - µmol CO2 m-2 s-1), стоматальной проводимости (gs - mol H2O m-2 s-1) и скорости транспирации (E - mmol m-2 s-1). Также была проведена оценка эффективности использования воды (EiUA - мкмоль CO2 ммоль H2O), рассчитанная по соотношению A/E. Оценки проводились с 9 до 11 часов утра при искусственном освещении (1000 мкмоль м-2 с-1) с использованием листьев, расположенных между вторым и третьим узлами плагиотропной ветви растений.
Для анализа данных использовалось статистическое программное обеспечение SISVAR. Для переменных отклика, которые показывали различия (p < 0,05), были скорректированы регрессионные модели, которые смогли объяснить максимальное изменение переменной как функции от доз гербицидов.