Мышцы и гистология спинного мозга и MN Количество передней большеберцовой (TA) и межреберной (IC) мышц и спинного мозга были быстро расчленены и удалены для последующего гистологического анализа и подсчета MN.
Мышцы взвешивали, фиксировали постфиксно в 4% ПФА в 0,1 Мб (рН 7,4), криопротектировали 30% сахарозой в 0,1 Мб ПБ, замораживали в тканях
Поперечные сечения криостата (толщина 16 мм), полученные из среднего брюшка мышцы, были окрашены гематоксилином и эозином.
При подсчёте MN в растворе Буэна спинальные мозги фиксировали и закрепляли в парафине.
Последовательные поперечные сечения (толщиной 14 мм), полученные по всему поясничному сегменту, были окрашены ГОСТом.
Видимо, здоровые MN, присутствующие в вентральном роге, были идентифицированы по их размеру и форме и подсчитаны слепо с одной стороны каждого 10-го отрезка.
Кратко говоря, были подсчитаны только MN с большим ядром, видимым скоплением ядерного материала и существенной цитоплазмой.
Общее количество MNs на вентральный рог было получено путем умножения количества клеток на 10. Иммуноцитохимия и визуализация
Для иммуноцитохимических исследований мышцы ТА и ИК, поясничный спинной мозг и спинной ганглии корня L4 (DRGs) были постфиксованы погружением в 4% PFA в 0.1 M PB, при pH 7.4, либо в течение 2 часов (в случае с мышцами), либо ночью (и DRGs.) (в случае спинного мозга).
Образцы тканей помещали в среду для замораживания тканей и замораживали.
Получены продольные (для мышц, толщина 16 мм) и поперечные (для спинного мозга и DRGs, толщина 14 мм) сечения серийных криостатов, которые затем хранились при 80 C.
Сечения последовательно промывали в течение 30 минут в фосфатно-буферной соли, содержащей 0,1% Тритон Х-100, затем блокировали в нормальной козьей сыворотке или обычной конечной сыворотке, а затем выдерживали в течение ночи с выбранным основным антителом.
Использовались следующие первичные антитела: козлиная поликлональная антиматричная металлопротеиназа-9 , разведенная 1:10; кролик.
После инкубации с первичным антителом секции промывали и затем инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа с соответствующими вторичными флуоресцентными антителами: DyLight 488-сопряженный ослик-антик-кролик; DyLight 549-сопряженный ослик-антикрыс или антикурица IgG; DyLight 649-сопряженный ослик-антимыш или антикурица IgG; Cy3-сопряженный осел-кролик, антимышь или антикоза IgG и Alexa Fluor 488-сопряженных козлиных антихимических IgG и Alexa Fluor 647-сопряженных осла антигинекологических свинок IgG (разведено 1:500; молекулярные зонды).
Сечения также окрашивали 40,6-диамидино-2-фенилиндольным дигидрохлоридом (ДАПИ) 50 нг/мл, молекулярными зондами для маркировки ДНК.
Мышцы также инкубировали с помощью Alexa Fluor 488-конъюгированного а-бунгаротоксина (a-Bgtx, разбавленный 1:500; молекулярные зонды) для идентификации постсинаптических рецепторов ацетилхолина.
Спинного мозга секции были окрашены с NeuroTrace 530 / 615 красный или 4555 синий флуоресцентный Nissl пятно (молекулярные зонды).
Слайды были исследованы эпифлюоресцентным микроскопом Olympus
BX51 (Олимп, Гамбург, Германия), оснащенным камерой DP30BW или конфокальными лазерными сканирующими микроскопами FluoView 500 или FluoView 1000 Olympus.
Для сравнения, слайды от разных животных и экспериментальных условий были обработаны параллельно для иммуноцитохимии и последующей визуализации.
Одни и те же параметры сканирования использовались для получения снимков, соответствующих различным экспериментальным группам.
Для иммуноцитохимических исследований спинного мозга, цифровые изображения всей поясничной области были получены из каждого 30-го отдела.
Электронная микроскопия Центральные и спинные нервные корешки были отдельно разрезаны, затем зафиксированы в 1% тетроксиде осмония и встроены в эпоксидную смолу EMbed 812 следуя стандартным процедурам.
Полумитиновые поперечные сечения (толщиной 1 мм), окрашенные метиленовым синим, были исследованы и отсняты с помощью погружного объектива Olympu) и цифровой камеры Nikon.
Ультратонкие сечения были окрашены ураниловым ацетатом и цитратом свинца, а затем обнаружены в электронном микроскопе.
Анализ изображений и морфометрическое обследование были выполнены в слепом виде двумя независимыми исследователями.
Цитоархитектура NMJs была проанализирована в продольных иммуностаинизированных участков мышц.
Получены и спроектированы с помощью программного микроскопа оптические секции с Z-образным стеком (толщина 1 мм) для реконструкции NMJ.
От пяти до девяти разделов были проанализированы для каждой мышцы и животного, и НМДж из случайно выбранных полей зрения были оценены для каждого экспериментального состояния.
Размер NMJ был оценен путем определения площади постсинаптического сайта под, который был вручную обозначен с помощью программного обеспечени. НМДж считался денервированным, когда доля постсинаптической поверхности, покрытой SV2-покрытой пресинаптическим терминалом с маркировкой Bgtx, составляла ножны.