1. Введение
Миогенез имеет решающее значение для ремоделирования скелетных мышц и поддержания качества. При повреждении мышц миобласты дифференцируются и сливаются, образуя миофибры и восстанавливая поврежденные волокна. Миобласты различаются и сливаются, сопровождаясь обильной экспрессией MyoD и миогенина.
У позвоночных было обнаружено, что ненормальная питательная среда препятствует дифференциации миобластов, уменьшает количество миофибры. По этим причинам большое внимание уделяется потенциальным механизмам воздействия питательных веществ на развитие и рост мышц. Высокий уровень глюкозы обычно считается фактором, вызывающим дисфункцию и повреждение тканей и клеток, широко известным как "токсичность глюкозы". Однако влияние и потенциальные молекулярные механизмы высокой концентрации глюкозы в окружающей среде на дифференциацию миобластов еще полностью не выяснены.
Недавно было доказано, что чрезмерное потребление калорий вызывает инсулинорезистентность (ИК), за которой следует мышечная атрофия. Инсулинорезистентность, сопровождающаяся митохондриальной дисфункцией, может подавлять синтез белка, вызывая потерю мышечной массы. Путь PI3K/AKT, ведущий к транслокации GLUT4, необходим при поглощении глюкозы и метаболизме, а также участвует в регуляции миогенной дифференциации. Таким образом, ИК и PI3K/AKT могут стать потенциальной терапевтической мишенью при дегенеративных мышечных заболеваниях, вызванных нарушениями обмена глюкозы.
Клетки C2C12, полученные из мышиных скелетных клеток мышц, являются хорошо зарекомендовавшей себя и отличной моделью для изучения миогенной регуляции и ее реакции на стимуляцию. Высокий уровень глюкозы эффективно подавляет миогенную дифференциацию, индуцируя инфракрасное излучение через ингибирование сигнала AKT.
2. Материалы и методы
2.1. Клеточная культура
Миобласты C2C12, полученные из Американской коллекции культуры, выращивались в модифицированной среде орла Dulbecco, содержащей 10% фетальной говяжьей сыворотки, 100 U/ml пенициллина и 100 μg/ml стрептомицина при температуре 37°C. Когда клетки достигли слияния 90%, среда была заменена на ДМЕМ с 2% сывороткой лошади для стимулирования дифференциации. Для наблюдения за влиянием высокой глюкозы на миогенез клетки С2С12 обрабатывали двумя концентрациями D-глюкозы в дифференцирующей среде в течение 5 дней. L-глюкозу использовали в качестве осмотического контроля для D-глюкозы 40 или 60 мМ. Миобласты C2C12 собирали через 1, 3 или 5 дней после обработки 40 или 60 мМ глюкозы для анализа временных курсов.
2.2. Жизнеспособность клеток
Жизнеспособность клеток оценивали методом анализа CCK-8. Клетки C2C12 обрабатывали 25 мМ Д-глюкозой, 25 мМ Д-глюкозой +15 мМ Л-глюкозой, 40 мМ Д-глюкозой, 25 мМ Д-глюкозой +35 мМ Л-глюкозой или 60 мМ Д-глюкозой. Через 5 дней после культивирования добавляли 10 мкл раствора CCK-8 и культивировали клетки в течение еще 1 ч.
2.3. Морфологический анализ для оценки образования миотрубок
Клетки ежедневно наблюдались с помощью фазового контрастного микроскопа для определения влияния высокого уровня глюкозы на морфологию C2C12. Для анализа из каждой конфокальной чашки Петри, содержащей клетки, обработанные 25, 40 или 60 мМ глюкозы в течение 0, 1, 3 или 5 дней, было случайным образом выбрано более восьми полей. Номер и площадь миотрубки были определены через 5 дней дифференциации с использованием этих изображений.
2.4. Иммунофлюоресцентное окрашивание
После обработки вышеуказанными концентрациями глюкозы в течение 5 дней клетки промывали PBS при 37 °C, фиксировали в 4% параформальдегида в течение 15 мин и подвергали иммунофлюоресценции для миотрубок и 4,6-диамидино-2-фенилиндольному окрашиванию для ядер. Затем клетки инкубировали первичным антителом против E-MHC или GLUT4, а затем инкубировали вторичным антителом - флуоресцентно-сопряжённым антимышечным антителом IgG или антикроличьим IgG, соответственно. Витражные клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом. Для каждого образца было отобрано более восьми полей на блюдо.
Высокий уровень глюкозы эффективно подавляют дифференциацию миобластов C2C12.
Во-первых, цитотоксичность 40 и 60 мМ глюкозы была исследована с помощью анализа CCK-8. Результаты показали, что высокая глюкоза не имела цитотоксичности на миобластах С2С12 во время дифференциации. Меньшее образование миотрубок в 60 мМ группе глюкозы. Однако клетки глюкозной группы 60 мМ экспрессировали меньше E-MHC, что сопровождалось меньшим образованием миотрубок. Глюкоза 40 мМ оказывала незначительное, но незначительное влияние на дифференциацию миобластов. Белки были понижены и в контрольной группе, и в 60 мМ группе глюкозы, и 60 мМ глюкоза не оказали существенного влияния на экспрессию Myf5. Экспрессия миоД и миогенина значительно увеличилась в контрольной группе во время дифференциации, но резко снизилась в 60 мМ группе глюкозы. В соответствии с экспрессией гена, экспрессия белков MyoD и миогенина также ингибировалась в глюкозной группе 60 мМ.