Уротелиальная карцинома является одной из наиболее злокачественных форм рака. В связи с высоким уровнем рецидивов и прогрессии, хирургическое лечение, такое как трансуретральная резекция опухолей мочевого пузыря является первой линией лечения рака мочевого пузыря.
По оценкам, в 2017 г. вероятность диагностирования рака уротелиальной системы у мужчин была в 3 раза выше, чем у женщин. Сигналы, связанные с гормонами, могут быть важными факторами развития рака мочевого пузыря. В частности, в механизме, связанном с андрогенными рецепторами, андрогенная депривация показана в качестве эффективного лечения рака мочевого пузыря. Энзалутамид не только препятствует связыванию AR с андрогеном, но и препятствует транслокации AR в ядро.
Сообщается, что аутофагия является эволюционно консервативным катаболическим процессом, который реагирует на клеточные стрессы активизацией защитных сил организма-хозяина через разрушающиеся органеллы и патогены. Основываясь на накопленных данных, аутофагия дисрегулируется при нескольких заболеваниях. Недавно было предложено провести аутофагию для защиты рака мочевого пузыря от ряда противораковых препаратов. Соответственно, мы предположили, что аутофагия, вызванная ENZ, представляет собой лекарственно-устойчивый механизм, защищающий клетки рака мочевого пузыря от апоптоза, вызванного ENZ.
Молекулярный механизм действия комбинированного лечения также модулировал антираковое действие на клетки рака мочевого пузыря.
Материалы и методы
1. Клеточная культура и наркотики
Клетки культивировались в RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и 1% антибиотика и антинаркотического раствора при 37 °C и 5% CO2 во влажной атмосфере. В качестве ингибиторов аутофагии использовались хлорохин, 3-метиленин и бафиломицин A1.
2. Анализ жизнеспособности клеток
Комплект для подсчета клеток-8 использовался для оценки жизнеспособности клеточных линий рака мочевого пузыря после лечения лекарствами. Поглощение каждой скважины было зафиксировано на 450 нм с помощью микропланшетного считывателя.
3. Вестерн-блот-анализ
Общая концентрация белка в каждой пробе была определена количественно с помощью набора для анализа белков BCA. Равное количество белковых лизатов смешивали с 5-кратным буфером загрузки страницы додецилсульфата натрия объемом 1:4 и затем варили при 100 °C в течение 5 минут. Лизаты клеток разделяли на SDS-полиакриламидные гели и переносили на мембраны из поливинилидендифторида. Мембраны PVDF были заблокированы 5% обезжиренным молоком в TBST. После промывки ТБСТ 3 раза в течение 7 минут каждая мембрану инкубировали ночью с 1:1000 разбавлением первичных антител при 4 °C. На следующий день мембраны инкубировали с 1:5000 разбавлением вторичных антител, связанных с пероксидазой хрена, в течение 60 мин при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы были обнаружены прибором ChemiDoc™ XRS+ с программным обеспечением Image Lab™ с использованием химически люминесцентного HRP Substrate.
4. Проточный цитометрический анализ клеточного цикла
После различных обработок клетки фиксировали 70% этанола в течение ночи. На следующий день образцы окрашивали 500 мкл смеси иодида пропидия (PI)/Рназы А (9:1) в течение 1 часа в темноте. Анализ клеточного цикла проводился с помощью проточной цитометрии.
5. Цитометрический анализ апоптоза с помощью проточной цитометрии
Для обнаружения апоптотических клеток после различных обработок в соответствии с протоколом производителя был использован комплект для двойного окрашивания. Лекарственно обработанные клетки отделялись от культивируемых пластин при помощи 0,25% трипсина и дважды промывались фосфатбуферным солевым раствором (PBS). Затем был добавлен буфер связывания, и камеры окрашивались в темное время суток при помощи приставки V-FITC и PI в течение 10 минут.
6. Генетическая регуляция клеточных линий рака мочевого пузыря
Специфичные для АТГ5 сирены трансформировались в клетки J82 и T24 в течение 48 ч для генетического ингибирования потока аутофагии.
Лентивирусы, содержащие плазмиду Ubi-AR-3×flag-SV40-EGFP-IRES-пуромицина, были приобретены у GENECHEM. Клетки Т24 были инфицированы чечевичными вирусами для стимуляции устойчивой сверхэкспрессии АО и отобраны с помощью 1 мкг/мл пюромицина.
ENZ индуцирует аутофагию в линиях клеток рака мочевого пузыря
Лечение ENZ значительно индуцировало колокализацию mRFP-GFP, а количество желтых и красных пунктировок на объединенных изображениях увеличилось, что подтверждает индукцию потока аутофагии при лечении рака мочевого пузыря методом ENZ. Для дополнительного подтверждения клеточные линии J82 и T24 обрабатывали без ENZ или 10, 20 или 40 мкм ENZ. Обработка ENZ значительно увеличила соотношение LC3-II/I и уровни АТГ5, фосфорилизованного AMPKα и фосфорилизованного ULK1 и снизила уровни p62 и фосфорилизованного mTOR. Обработка ENZ также значительно увеличила уровни некоторых генов, связанных с аутофагией, таких как AMPK, ATG5, LC3B и ULK1 (P <0,05).