Материалы и методы
1. Трансфекцию плазмиды и РНТ вводили на линию клеток RAW264.7.
RAW264.7 Клетки культивировались в модифицированной среде орла Dulbecco, содержащей 12% сыворотки крупного рогатого скота при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Плазмиды интерференции РНК и их отрицательный контроль были приобретены у GenePharma. RAW264.7 ячейки были покрыты 24-луночной пластиной с плотностью 2 × 105. Трансфекцию проводили с использованием системы трансфекции Lipofectamine™ 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Использовались два микрограмма плазмиды и 3,5 мкл липофектамина-2000. После 24-часовой инкубации селекцию NaV1.4-дефицитных клеток и глушителя-отрицательного контроля проводили с помощью 400 мг/мл гигромицина B в ДМЕМ. NaV1.9-дефицитные клетки и отрицательный контроль глушителя были отобраны с 500 мг/мл G418. Три группы ячеек RAW264.7 были покрыты с плотностью 1 × 106 в 6-луночных пластинах и, кроме контрольной группы, PHT были добавлены еще в две группы по 24 ч и 48 ч.
2. Изоляция моноцитов ApoE-/- мыши периферических кровотоков крови
Цельная мышиная кровь была собрана в антикоагулянтные трубки из этилендиамина тетрауксусной кислоты и лизирована с помощью буферного раствора лизиса РБК. К обычной сыворотке крови крыс и коктейлю для обогащения моноцитов мыши EasySep™, инкубированной в течение 15 минут и центрифугированной, добавляли суспензию клеток в концентрации 5 × 107 мл. Добавлен коктейль для отбора биотина EasySep™, клетки культивировались в течение 15 минут. Затем были добавлены магнитные частицы EasySep™ D и выдерживались в течение 10 минут. Наконец, объем суспензии камеры был увеличен до общего объема 2,5 мл. Ячейки откладывались на 5 минут, а магнит и трубка переворачивались, сливая желаемую фракцию в новую трубку из полистирола объемом 5 мл, и обогащенные моноциты в новой трубке были готовы к использованию.
3. Экспрессия мРНК VGSC в моноцитах ApoE-/- мыши периферической крови и клетках RAW264,7
Подход, основанный на ПЦР, использовался для последовательности кДНК VGSC, полученной из моноцитов периферической крови мыши и клеток RAW264.7. После 10-14 дней культивирования и трех субкультур из моноцитов ApoE-/-мыши в соответствии с инструкциями производителя была извлечена общая РНК с использованием TRIzol. КДНК была синтезирована из 1,5 мг общей РНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV и олиго 18. Уровень экспрессии генов количественно определялся прибором ABI 7300 qPCR реального времени с предварительно оптимизированными условиями.
4. Экспрессия фенотипических маркеров в разных клетках организма
Плазмидно-трансформированные клетки были посеяны в 24-х луночный планшет и прогрунтованы свежей средой, дополненной различными стимулами для получения градиента полярности фенотипов, как уже сообщалось. ЛПС и ИЛ-4 использовались в течение 16 ч для поощрения дифференциации фенотипов M1 и M2, соответственно. Извлечение суммарного синтеза РНК и кДНК производилось, как уже отмечалось выше. В качестве маркеров поляризации М1 использовались лиганд 5 и синтаза окиси азота хемокина; для поляризации М2 - аргиназа 1 и рецепторный белок манноза С1. Относительные уровни экспрессии рассчитывались как нормализованная разница значений КТ между контрольной группой и образцом с поправкой на эффективность усиления по отношению к уровню экспрессии β-актина.
5. Мыши и диеты
Все животные получали стандартный рацион питания для коров или западный рацион питания, содержащий 21% жира и 0,5% холестерина.
6. Модель атеросклероза
Для данного исследования использовали мышей ApoE-/-. Их помещали на западную диету или на стандартную диету коров в течение 10 недель. Затем были собраны 10 особей группы WD и 10 особей группы CD, остальные мыши были разделены на три группы: 1) WD + PHT; 2) WD + нормальный солевой раствор; и 3) CD + NS еще на 4 недели.
7. Конфокальная визуализация
Ткани были получены от мышей, которые были принесены в жертву в нужное время и зафиксированы в 4% параформальдегида в 0,01 M PBS в течение 24 ч. Корни аорты были последовательно секционированы. Последовательные срезы по 5 мкм через каждые 80 мкм вдоль 230 мкм сегмента корня аорты выполнялись через каждые 80 мкм. Первая часть ткани каждого сегмента была окрашена гематоксилином/эозином. Прилегающие участки иммунизировали с помощью F4/80 для макрофагов и Ki67 для пролиферирующих макрофагов. Ткани блокировали раствором нормальной козлиной сыворотки в PBS в течение 30 минут, а затем промывали 0,01 М PBS. Слайды инкубировали с первичными антимышечными антителами крыс F4/80 и анти-Ki67 в течение ночи при 4℃.
Экспрессия VGSC <и VGSC ® в клетках RAW264.7 и моноцитах ApoE-/-мыши периферической крови
В моноцитах периферической крови мыши основными изоформами VGSC были NaV1.1, NaV1.3, NaV1.4, NaV1.5, NaV1.6, NaV1.7, NaV1.8, NaV1.9 и NaVX. Все четыре изоформы могут быть обнаружены в моноцитах периферической крови мыши. мРНК NaV1.4 и NaV1.9 были высокоэкспрессированы в моноцитах и клетках RAW264.7. Экспрессия NaV1.2 мРНК подтверждена в дорсальных корневых ганглиях мыши.