Материалы и методы
1. Гормональное вещество
Свиной пролактин (PRL) молекулярной массой 23,4 кДа, изоэлектрическая точка (pI) = 4,97, форма - лиофилизированное сухое вещество. Чистота ЛВП составляла более 98% и определялась полиакриламидным гелевым электрофорезом (ПАА) и ВЭЖХ.
2. Вспомогательные вещества
Трехалоза - форма - белый, кристаллический порошок, C12H22O11 x 2H2O, M.W. 378.3.
D-манитол - форма - белый, кристаллический порошок, C16H14O6, M.W. 182.2.
3. Модель мембраны - порезанный тонким кишечником диск 1-дневного сосательного поросенка.
После удаления кишечника из туши и его расчленения промывали раствором NaCl 0,9% до значения поглощения E < 0,02 при длине волны λ = 278 нм. Это была длина волны, специфичная для PRL. Для исследования использовали срезы тонкого кишечника массой 100 ± 10 мг.
4. Подготовка и состав растворов пролактина для перорального применения
Выполнение - до 8 мл 0,9% раствора NaCl добавляли ПРЛ, соответствующее количество тригалозы и маннитола. Весь раствор помешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин, а затем доводили до соответствующего pH раствором 0,1 мл HCl и составляли до объема - 10 мл. Для приготовления растворов пролактина для перорального приема был использован оптимальный двухуровневый план.
В представленной матрице переменные были протестированы на трех уровнях:
Верхнее - (+1); нижнее - (-1) и основное (0). Базовый уровень означает оптимальное базовое решение для абсорбции и проницаемости со следующим составом: PRL 0,5 мг/мл, тригалоза 12 мг/мл, маннитол 12 мг/мл, рН 3,0. Эксперимент проводился по значениям независимых переменных, отобранных таким образом, чтобы максимально отразить условия в системе.
Из приготовленных растворов пролактина различного состава изучен процесс всасывания и проникновения гормона через тонкий кишечник в условиях моделируемом состоянии. На основании полученных результатов определено влияние состава раствора PRL:
X1 - концентрация пролактина в растворе (0,25 мг/мл или 0,50 мг/мл или 0,75 мг/мл),
X2 - концентрация трехалозы в растворе (6 мг/мл или 12 мг/мл или 18 мг/мл),
X3 - концентрация маннитола в растворе (6 мг/мл или 12 мг/мл или 18 мг/мл),
X4 - значение pH раствора (2.5 или 3.0 или 3.5).
5. Исследовательский курс
В эксперименте исследовательской моделью была стандартная диффузионная ячейка Франц. Камера состояла из двух одинаковых тел с плоским заземлением объемом 2,0 мл. Одним органом была донорская палата (D), а другим - акцепторная палата (A). Тела были снабжены входным и выходным каналом. Отсеки (D) и (A) отделялись друг от друга естественной мембраной - тонкой кишкой в виде разрезанного диска. Стена кишечника была направлена в донорскую камеру, а снаружи в акцепторную камеру. В исследованиях использовался метод "параллельно", при котором компартменты (D) и (A) находятся на одном и том же уровне.
Донорская камера (D) заполнялась 2,0 мл раствора с соответствующим составом с соответствующим pH (2,5 или 3,0 или 3,5), который содержал растворенную PRL в соответствующей концентрации, тригалозу при концентрации соответственно (6 мг/л или 12 мг/л), или 12 мг/л, либо 6 мг/л. Акцепторная камера (А) - наполнена 2,0 мл жидкости при соответствующем pH (2,5 или 3,0 или 3,5). После 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3; 3,5; 4; 4; 4,5 и 5 ч, из акцепторного отделения (А) выводится весь объем жидкости с соответствующим pH и добавляется 2 мл свежей порции.
Количество поглощенного PRL [%] рассчитывалось из разницы: (D) - (A),
где:
(D) - общее количество ЗВП, оставшееся в донорской камере (D) после 5 ч эксперимента [%].
(А) - общее количество ЛВП, проникшее в кишечник через 5 ч эксперимента [%].
На основании полученных результатов определены параметры, характеризующие кинетику процесса всасывания и проникновения PRL через тонкий кишечник поросят-сосунков 1 сутки: постоянная скорость всасывания и проникновения (k) и период полураспада всасывания и проникновения (t50%). Константы поглощения и скорости проникновения PRL (k) рассчитывались по формуле: k = lnC1 - lnC2 / t2 - t1 [h-1], где:
C1 - общая концентрация ЛВП в растворе в момент времени t1 = 0 ч (акцептор) [%];
C2 - общая концентрация ЛВП в растворе в момент времени t2 = 5 ч (донор) [%].
Полуабсорбция и время проникновения PRL [t50%] рассчитывались по формуле: t50% = 0,693/k.
Результаты сравнивали с раствором, содержащим 0,25 мг/мл пролактина.
6. Статистические расчеты
Полученные результаты представлены в виде средних значений из 10 образцов. Рассчитано среднеквадратическое отклонение (SD). С помощью дисперсионного анализа была определена значимость влияния 4 независимых переменных: пролактина, трехалозы, маннитола [X3] и рН раствора для поглощения и проникания PRL через кишечник. Были рассчитаны существующие взаимозависимости между независимыми переменными и степенью поглощения и проникновения PRL.
Результаты
Из приготовленных растворов различного состава были изучены условия всасывания и проникновения PRL через тонкий кишечник сосательных поросят в течение 1 дня.
