Загрязнение тяжелыми металлами в результате антропогенной деятельности является одной из основных экологических проблем в современном мире. Прогресс в создании модифицированных растений, более эффективных в фиторемедиации, требует понимания анатомических и ультраструктурных изменений, связанных с накоплением тяжелых металлов.
--------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Культура растений и экспериментальное проектирование
Семена рапса сорта Hayola 401 были подготовлены Центром сельскохозяйственных исследований и природных ресурсов Хорасан-Разави, Мешхад, Иран.
Семена стерилизовали 10% раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин, трижды тщательно промывали деионизированной водой, пропитывали ей же в течение 2 ч, а затем культивировали гидропонично с перлитом в качестве вспомогательного материала.
Семена были посеяны в пластиковых емкостях объемом 1,5 л, заполненных перлитом, и разделены на две группы. В контрольной группе горшки кормили 10%-ным питательным раствором Hoagland. В другой группе горшки кормили таким же количеством питательного раствора Hoagland, содержащего 350 мкМ Zn2+, приготовленного путем растворения соответствующего количества ZnSO4 .7H2 O в деионизированной воде.
Концентрация обработки (350 мкМ) была выбрана после первичного исследования для определения первой оценки порогов токсичности. Для этого было исследовано влияние различных концентраций Zn2+ на рост рапса, а затем выбрано максимальное значение Zn2+, переносимое рапсом, в соответствии с параметрами роста.
Более того, предыдущие исследования, исследующие влияние широкого диапазона концентраций Zn2+ на некоторые параметры роста рапса, дали хорошую оценку токсичности Zn.
Растения выращивались при температуре 25 ± 1 °C в течение 16/8-часового фотопериода. Питательный раствор каждой группы обновлялся каждые 10 дней. Для этого кастрюли были полностью промыты дистиллированной водой, а затем поданы в них соответствующие питательные растворы, из которых промывочная вода была удалена.
Прочность питательного раствора была увеличена до 25% и 50% во втором и последующих обновлениях, соответственно. Ежедневно взвешивали кастрюли и устраняли потерю веса, добавляя питательный раствор. Через два месяца после посадки растения были собраны для последующего анализа.
Микроскопический анализ
Корневые сегменты длиной около 2 мм были обрезаны на 1 см выше кончика корня и примерно на 1 см выше места стыка ветви и стержня.
Прямоугольные сегменты листа (1 × 2 мм) были сечены от шестого листа, между третьей и четвертой основными боковыми жилами, и немедленно перенесены на 4% глутаральдегид в какодилатный буфер 0,1 М (pH 7,4) при 4 °C для фиксации на ночь.
После трехкратного ополаскивания одним и тем же буфером в течение 15 минут образцы помещались в 1% OsO4 в том же буфере в течение 2 ч, после чего трижды промывались в том же буфере.
Сегменты были обезвожены в ряде сортов этанола (30%, 50%, 70%, 90% и 100%), а затем в течение ночи были пропитаны смолой. На ультрамикротоме были разрезаны участки семитина (1 мкм) и ультратонкого (80 нм).
Полумитиновые разрезы наблюдали с помощью светового микроскопа, подключенного к цифровой камере после окрашивания 1% толуидиновым синим в 1% бура. Ультратонкие сечения устанавливались на медные решетки и затем наблюдались с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
В настоящем исследовании были подготовлены различные разделы. Однако лучшая секция, будучи хорошей репрезентативной, была выбрана для изучения анатомических и ультраструктурных изменений. Изменения, которые полностью отличались от изменений на контрольной станции, были описательно исследованы без количественного анализа. Например, хотя размер крахмальных зерен является качественным параметром, их изменения по сравнению с контролем были настолько очевидны, что их не нужно было измерять количественно. Однако количественно исследованы такие параметры, как размер клеток, количество хлоропластов и размер митохондрий. Для измерения размера ячейки определялся диаметр десяти ячеек, а затем рассчитывался средний размер. Для измерения размера клеточных органелл определялся диаметр десяти органелл из данной клетки и рассчитывался средний размер. Количество хлоропластов подсчитывалось более чем в 20 мезофильных клетках и фиксировалось среднее число для каждой клетки.
Определение содержания Zn в корнях и листьях растений
Корни и листья растений сушили при 70 °C в течение 48 ч. Высушенные образцы измельчали в мелкий порошок и 0,5 г каждого порошка переваривали 5 мл HNO3 и 1 мл 30% H2 O2 , после чего нагревали при 90 °C.
Корни и листья растений сушили при 70 °C в течение 48 ч. Высушенные образцы измельчали в мелкий порошок и 0,5 г каждого порошка переваривали 5 мл HNO3 и 1 мл 30% H2 O2 , после чего нагревали при 90 °C. Последние две стадии процесса длились до тех пор, пока реакция не прояснилась. После очистки нагрев продолжался до почти сухости.
После очистки от осадка пробы процесс разогрева продолжался до полного высыхания. Наконец, остатки процесса сбраживания были растворены разбавленным HNO3 и доведены до конечного объема 25 мл с деионизированной водой. Содержание Zn в экстрактах корней и листьев определяли атомно-абсорбционной спектрометрией.
Статистический анализ
Имелось по три копии для каждой группы, сгруппированные в полностью рандомизированном порядке. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA), за которым последовал тест Дункана на определение множественного диапазона, использовался для проверки значительных различий и сравнения средних значений с MSTAT-C. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения.
Существенная разница была определена как P <0.05.
Результаты
Бионакопление Zn в корнях и листьях растений, обработанных 350 мкМ Zn2+, по сравнению с контролем значительно возросло. Результаты показали, что содержание Zn в корнях и листьях растений, обработанных Zn, в 5,7 и 6,42 раза выше, чем у контрольных растений, соответственно.
Анатомия корня и ультраструктура Поперечные сечения кончиков корней обработанных Zn растений показали уменьшение количества корковых и звездчатых клеток и уменьшение диаметра кончика корня по сравнению с контролем. Световые микроскопы показали, что наиболее уязвимой тканью клеток кончика корня при лечении Zn является эпидермис.
Корневые эпидермальные клетки обработанных цинком растений деформировались и сокращались, имея меньший размер, чем у контрольных. Диаметр стелы и размер перицикловых ячеек также уменьшились под воздействием напряжения Zn.
Хотя количество сосудистых клеток оказалось меньше по сравнению с контрольной группой, их размер, казалось, был больше. Световые микрограммы примерно на 1 см выше стыка ветви и стержня показали, что при избытке Zn диаметр стелы и количество ее клеток уменьшились, а проводящие клетки ксилема и флоемы были меньше контрольных.
Микрограммы TEM клеток коры головок коры растений, обработанных цинком, показали осаждение цинка в стенках клеток. Эти клеточные стены имели разную толщину в разных местах и были деформированы в определенных местах. Другие обнаруживаемые и заметные ультразвуковые изменения в клетках коры растений, обработанных цинком, не наблюдались.
На ТЭМ-изображении сосудистой ткани кончика корня контрольных растений показано наличие крупного крахмального зерна в пластиках нескольких сосудистых клеток. Однако у растений, обработанных цинком, эта особенность не наблюдалась. Кроме того, несколько пластиков более поздних клеток были деформированы и неправильно сформированы в растениях, подвергшихся дроблению. Осаждение Zn наблюдалось в вакуолях и межклеточных пространствах сосудистой ткани. Звездные клетки кончиков корней выявили избыточный Zn-индуцированный распад митохондрий.
Содержание цинка в почве составляет от 60 до 89 мг/кг.
Критический уровень токсичности Zn в листьях сельскохозяйственных культур составляет около 300 мг/кг сухого веса. В после проведенных исследований выяснилось, содержание цинка в листьях составляет 1600 мг/кг сухого веса.
Многие исследования показали, что высокое накопление цинка может привести к функциональным и структурным изменениям в различных частях растения. Поскольку корень является первой целевой тканью, подверженной воздействию высоких концентраций тяжелых металлов, функциональные и структурные нарушения чаще проявляются в корнях, чем в надземных частях растения.