1. Материалы и методы
1.1. Сбор данных
Данные РНК-секвенирования рака шейки матки и соответствующих нормальных контролей были загружены с портала данных TCGA в марте 2019 года, а данные были нормализованы пакетом R "Limma". Соответствующая клинико-патологическая информация и данные о выживаемости были получены и интегрированы в данные РНК-квадрат. Матричный файл серии каждого набора данных GEO был загружен и объединен, а процесс пакетной нормализации проводился с использованием пакетов R "sva" и "Limma". Затем СИБЕРСОРТ определил подпопуляции ТИЦ. Предыдущие исследования показали, что иммунопостовые модуляторы, участвующие в иммунном ответе, опосредованно влияют на дисфункцию TIL. В данном исследовании были проанализированы 17 молекул, которые были определены как важнейшие иммунные модулирующие вещества, на их прогностическую ценность при раке шейки матки.
1.2. Перечисление опухолевых иммунных клеток, дезинфицирующих опухоли
В число 22 подтипов иммунных клеток, проанализированных CIBERSORT, входят Т-клетки, В-клетки, NK и миелоидные подмножества. Для оценки фракций этих 22 подпопуляций ТИК использовались стандартные данные экспрессии генов. Пакет "CIBERSORT.R" был запущен для создания пропорциональной матрицы ТИЦов при раке шейки матрицы с сигнатурной матрицей по умолчанию при 100 перестановках. Для дальнейшего изучения были отобраны только образцы с p-значением CIBERSORT < 0,05.
1.3. Статистические исследования
Анализ связей между ТИЦ или иммуномодуляторами и ОС проводился с помощью кривых Каплана-Мейера и одномерных моделей пропорциональной регрессии угроз Cox. Кроме того, иммунные клетки или молекулы были подвергнуты дальнейшей оценке для определения их прогностической независимости с помощью многомерных моделей пропорциональной регрессии угроз Cox. Модель для оценки риска была построена в соответствии с информационным критерием Акаяке. Прогнозная мощность модели оценивалась по кривым характеристики приемника и С-индексу. Все анализы проводились с использованием Rstudio, и результаты с p <0.05 были признаны значимыми.
2. Результаты
2.1. Распределение ТИК и прогностическая ценность при раке шейки матки в когорте ТКГА
В общей сложности 255 плоскоклеточных рака шейки матки и 2 нормальных контроля были доступны от TCGA. Наивные CD4+ Т-клетки были исключены из анализа, так как они были редкими инфильтратами во всех образцах. Пропорции различных подпопуляций ТИЦ были слабо или умеренно коррелированы.
Для оценки прогностической ценности ТИЦ мы исследовали выживаемость пациентов в соответствии с различными схемами распределения ТИЦ. Анализ выживаемости Каплана-Мейера показал, что 4 инфильтрата в значительной степени связаны с улучшенным прогнозом развития рака шейки матки, а 4 других инфильтрата были связаны с улучшенным прогнозом выживания.
2.2. Прогностическое моделирование ТИЦов при раке шейки матки
Прогнозные факторы для ОС, выявленные с помощью одномерного анализа Кокса, были дополнительно проанализированы на предмет независимости в многомерной модели Кокса. Результаты показали, что клетки активной памяти CD4+T являются независимыми защитными факторами с соотношением опасностей 0,71, а клетки активной мачты - независимыми факторами риска 1,53. Впоследствии на основе коэффициентов регрессии была создана прогностическая модель, модель aTMNs. Эта модель была в состоянии рассчитать прогнозный показатель риска развития рака шейки матки по следующей формуле:
Оценка риска = -0.345080 × (доля CD4+ Т-клеток активной памяти) + 0.426841 × (доля активированных мачтовых клеток) + 0.272202 × (доля активированных клеток НК). Пациенты с раком шейки матки были разделены на группы низкого и высокого риска по медианной оценке прогностического риска. Кривая риска и состояние выживаемости пациентов показали, что у пациентов с высоким риском, как правило, прогноз хуже, чем у пациентов с низким риском. Активированные мачтовые клетки и клетки НК обогащались в группе высокого риска, а клетки активной памяти CD4+T обычно распределялись в группе низкого риска.
2.3. Оценка ТИЦ при раке шейки матки в когорте ГЕО
Для проверки структуры распределения ТИЦ в качестве подтверждающего набора данных применялась когорта ГНЗ. В общей сложности 129 биопсий плоскоклеточного рака шейки матки и 24 нормальных контроля были доступны от GEO. Пропорции субпопуляций иммунных клеток показали высокую степень согласованности между TCGA и GEO когортами. Аналогично данным, полученным с помощью когорты TCGA, корреляционные закономерности были слабо или умеренно коррелированы между иммунными клетками. Скрипичный график показал различные профили иммуноклеточного состава между образцами рака шейки матки и нормальным контролем. По сравнению с паракальной тканью раковая ткань шейки матки в целом содержала более высокие пропорции макрофагов М0, макрофагов М1, покоящихся НК-клеток, фолликулярных вспомогательных Т-клеток и нейтрофилов, а клетки памяти CD4+T, дендритные клетки, покоящиеся мачтовые клетки и моноциты были относительно ниже.