Материалы и методы
1. Заявление по вопросам этики
Все экспериментальные протоколы были утверждены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Северо-Восточного сельскохозяйственного университета.
2. Изоляция и культура САДК
АДСК были выделены из паховой подкожной жировой ткани баминских миниатюрных свиней. Короче говоря, жировую ткань промывали PBS, разрезали на мелкие кусочки и переваривали в PBS, содержащую 1 мг/мл коллагеназы типа Ⅰ с мягким перемешиванием при 37 ℃ в течение 50 минут. Затем взвешенную суспензию перевариваемых элементов центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. После удаления непереваренной жировой ткани для прекращения пищеварения добавляли одинаковый объем L-DMEM, содержащий 10% сыворотки крупного рогатого скота. Смесь фильтровалась через сетчатый фильтр 100 мкм для удаления непереваренных фрагментов ткани. Перевариваемую ткань центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Затем осадки собирали и выдерживали с помощью эритроцитов лизата в течение 5 мин. Повторно взвесь клеточного пеллета в L-DMEM добавляли 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 100 мкм/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Собранные клетки были покрыты колбами 25 см2 клеточной культуры и выращены при температуре 37 ℃ в 5% увлажненном инкубаторе CO2.
3. Солевой препарат с высоким содержанием водорода
Водород был изготовлен из генератора водорода и растворен в физиологическом соле 0,4 МПа в течение 4 ч до пересыщенного уровня. Определение концентрации HRS с помощью портативного измерителя содержания растворенного водорода.
4. Экспериментальная конструкция
Восемнадцать миниатюрных баминских свиней со средней массой тела 25-35 килограммов выращивались на одном и том же рационе и имели свободный доступ к воде. Свиньи были разделены на 3 группы. Все свиньи получали лапароскопическую левобережную гепатэктомию и правую ишемию печени в течение 60 мин, как описано выше. В группе АДСК препараты (1×106/кг) готовили во взвешенном состоянии с нормальным физиологическим раствором 5 мл, а затем медленно вводили в правую паренхиму печени путем многоточечной пункции сразу после гепатэктомии левого полушария. В группе HRS препарат вводили в воротную вену за 10 мин до реперфузии и на 1, 2 и 3 день после операции. Образцы тканей печени собирали до операции и после операции в 1 d, 3 d и 7 d с помощью лапароскопической хирургии. Образцы крови из передней вены отбирали до операции и на 1, 3 и 7 день после операции.
5. Биохимический анализ образца крови
Образцы крови центрифугировались при 3500 об/мин в течение 15 минут и собирали сыворотку крови.
6. Определение уровня MDA и активности СОД, КАТ, GSH-Px
Ткань печени промывали, взвешивали, а затем добавляли 9 томов 0,9% нормального физраствора. В условиях ледяной ванны 10% раствор гомогената был получен с помощью тканевого гомогенизатора. После центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 минут при температуре 4 ℃ собирали гомогенат супернатанта. Уровень MDA и активность SOD, CAT, GSH-Px измерялись с помощью наборов анализов в соответствии с инструкциями производителей.
7. Количественный ПЦР-анализ уровня мРНК в режиме реального времени
Общее количество РНК ткани печени выделено с использованием реагента Trizol в соответствии с инструкциями производителей. Затем РНК обратно транскрибируется в кДНК с помощью набора реагентов PrimeScript RT с ластиком ГДНК. Реакционная смесь qRT-PCR состояла из 1 мкл кДНК, по 0,3 мкл наперед и назад, 3,4 мкл dH2O и 5 мкл SYBR Green Master. Относительная экспрессия мРНК рассчитывалась методом 2-ΔCt.
8. Гистологический анализ
Ткань печени фиксировалась в 4% параформальдегида и закреплялась в парафине стандартными методами. Затем срезали и окрашивали гематоксилином и эозином 5 мкм сечений.
9. Иммуногистохимическое окрашивание
Образцы свежей печени фиксировали в 4% параформальдегиде и помещали в парафин стандартными методами. Сечения тканей размером 5 мкм были обезвожены и обезвожены в стандартном порядке. Тканевые секции были погружены в 3% раствор пероксида водорода для устранения эндогенной пероксидазы. Затем участки тканей погружали в буфер лимонной кислоты на 0,1 млн. м для восстановления антигенов и блокировали БСА. После инкубации на ночь с основным антителом при температуре 4 ℃. После промывки PBS секции инкубировали козлиным анти-кроликом Ig G с этикеткой HRP при комнатной температуре в течение 30 минут.
Сравнение влияния HRS и ADSC на уровень АЛТ, АСТ, ТБИЛ, АЛП и ТП в сыворотке крови
Результаты показали, что в группе HRS и ADSCs значительно снизились уровни АСТ, туберкулеза при 1 d и 3 d (P <0,05, P <0,01) по сравнению с группой ИРИ. Уровень АЛТ в группе ADSCs на уровне 1 d и 3 d (P <0.05, P <0.01) и в группе HRS на уровне 3 d (P <0.05) был заметно снижен. При лечении HRS и ADSCs активность ALP снижалась при 1 d и 3 d, TP слегка увеличивалась при 1 d и 3 d, но она не изменилась значительно по сравнению с группой IRI. По сравнению с группой HRS, уровни АСТ в группе АДСК значительно снизились при 1 d (P <0,05), АЛТ и ТБИЛ при 3 d (P <0,05).
