Материалы и методы
1. Животные
Взрослые самцы крыс Sprague-Dawley в возрасте 6-9 месяцев, весом 250-300 г, были приобретены в Центре экспериментальных животных при Куньминском медицинском университете. Крыс держали в крысиных клетках в комнате для животных на 12-часовом светло-темном цикле и кормили стандартным пеллетным кормом и водой из либитума. Животные содержались и лечились, а эксперименты проводились в соответствии с условиями, оговоренными в методических указаниях комитета по этике Куньминского медицинского университета.
2. Протокол
В этом исследовании, шесть крыс были разделены на декседетомидин группы и контрольной группы. Крысам в группе декседетомидина вводили декседетомидин внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, а крысам в контрольной группе - 1 мл нормального физиологического раствора внутрибрюшинно. Сердца были вырезаны через 30 минут после введения декседетомидина или нормального солевого раствора под эфирной анестезией. Сердца дважды промывали буферизованным солевым раствором при температуре 4 °C и сразу же помещали в жидкий азот. Дозировка декседетомидина (100 мкг/кг), которую мы использовали, была максимальной безопасной дозой]. Кроме того, обоснование дозы декседетомидина и времени жертвоприношения основано на предыдущем исследовании, в котором крысы подвергались ишемии миокарда/реперфузионному инсульту через 30 мин после введения декседетомидина (100 мг/кг внутрибрюшинно). DEX был связан с уменьшением размера инфаркта при ишемии / реперфузионной травме при региональной ишемии.
3. Извлечение РНК
В соответствии с инструкциями производителей общая РНК была выделена и очищена с помощью ТРИЗОЛа и РНизи мини-комплекта соответственно. Для измерения качества и количества РНК использовался нанотропной спектрофотометр. Для определения целостности РНК применялся гель-электрофорез. Критерием включения для последующего количественного анализа миРНК с массивом миРНК Exiqon являлось соотношение A260/A280 между 1,8 и 2,1.
4. Маркировка миРНК и гибридизация массивов
Согласно руководству Exiqon, после проведения контроля качества для маркировки miRNA после завершения процедуры маркировки в соответствии с руководством производителя был использован комплект для маркировки miRNA, массив miRCURYTM LNA был использован для гибридирования маркированных образцов в соответствии с данным руководством. После гибридизации слайды были подготовлены и промыты с помощью комплекта промывочного буфера. Затем для сканирования слайдов был использован микромассивный сканер Axon GenePix 4000B.
5. Анализ микро-РНК микромассивов
Затем отсканированные изображения были импортированы в программное обеспечение для выравнивания сетки и извлечения данных. Для расчета коэффициента нормализации были выбраны miRNA с интенсивностью >=30 в образцах. Для нормализации выраженных данных использовалась медианная нормализация. После нормализации аберрантно выраженные miRNAs были оценены через изменение складки и P-значения. Неправильно выраженные miRNA были отфильтрованы с помощью функции смены складки.
6. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR) для дифференциальной валидации микроРНК в режиме реального времени (qRT-PCR)
Получена суммарная РНК с использованием реагента TRIzol. КДНК синтезирована из 1,0 мг общей РНК с помощью транскриптора FirstStrand cDNA Synthesis Kit. Реакция обратной транскрипции проводилась при следующих условиях: 16 °C в течение 30 минут, 42 °C в течение 40 минут и 85 °C в течение 5 минут. Целевые миРНК каждого образца и внутреннего эталона были исследованы с помощью Прикладные биосистемы. Все RT-PCR в режиме реального времени проводились с SYBR® Green qPCR Master Mix. ПЦР проводили с использованием следующих циклических условий: 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 60 с, 95 °C в течение 15 с. Для количественных результатов выражение миРНК выражалось в изменении складки с помощью метода 2-ΔCt. Различия в экспрессии миРНК между ДЕКСом и контрольной группой анализировали с помощью t-теста Студента.
7. Биоинформационный анализ
GO и KEGG были использованы для функционального анализа и анализа путей распространения генов-мишеней соответственно.
8. Статистический анализ
Значительно выраженные миРНК были определены как миРНК с увеличенным или уменьшенным изменением складки выше 1,5, а значения P были ниже 0,05 по сравнению с контрольной группой.
Результаты
Коэффициент корреляции Пирсона показал высокую степень корреляции. Анализ микрочипов выявил 533 из 709 предварительно нагруженных миРНК (75,6%). Из них шесть миРНК по-разному экспрессировались в декседетомидиновой группе по сравнению с контрольной группой.
miRNA-208b-3p была значительно ниже-регулирована по сравнению с контролем (P <0.011), тогда как miRNA-434-3p (P <0.040), miRNA-3596d (P <0.008), miRNA-496-5p (P <0.024), miRNA-7a-2-3p (P <0.008), miRNA-496-5p (P <0.024), miRNA-7a-2-3p (P <0.01g), mi-R1-3p-2-3p.