Подготовка и характеристика экстракта
В соответствии со стандартами EN ISO 10993:5 и 10993:12 были получены экстракты чистого мг (чистый мг, 99,95%), мг с 2 массами серебра (мг-2Аг) и мг с 10 массами гадолиния (мг-10Гд). Чистые элюты характеризовались и растворялись в дифференцирующей среде для получения общей концентрации Mg.
Индукция образования микропеллеров и хондрогенной дифференциации
Этическое разрешение на изоляцию HUCPV было получено от Этической комиссии по охране окружающей среды города Гамбурга. Образцы пуповины были предоставлены Клиникой Асклепиос Альтона сразу после кесарева сечения добровольно сделанных доноров. Клеточные микромассы были получены из таблеток клетки HUCPV через 3 дня. Затем хондрогенез подвергался химическому воздействию в течение 11 дней с экстрактами Mg или без них, после чего проводился протеомный анализ. Для каждой группы было создано 3 биологических реплики. Кроме того, было выполнено 3 технических реплики. Контрольная группа - это микропеллеры, направленные к хондрогенезу без экстракта Mg.
Протеомный анализ
Белки из гранул извлекали с помощью TissueLyzer II (QIAGEN), переваривали триптическим раствором, а затем обессоливали.
Для измерения жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии все триптические перевариваемые пептиды подвергались воздействию нанопоточной УПЛК-колонки.
Для сравнения относительного содержания белка файлы исходных данных, полученные с помощью ЖХ-МСМ, были обработаны MaxQuant 1.5.2.8. Эти параметры использовались для идентификации и количественной оценки без меток: идентификация пептидов по базе данных SwissProt, загруженной из UniProt в июле 2015 года; трипсин использовался в качестве фермента с одним пропущенным расщеплением; карбамидометилирование по цистеину - для фиксированного изменения и окисления метанина как переменные изменения; определение допустимой массы фрагмента D 20 ppm; определение карбамидометилирование по кистеинам - для фиксированной и окислительной длины и минимальной дозе для окистепина 0,5 ppm; определение приемлемых значений допутина - для исходных изменений.
Совпадение пептидного спектра (PSM) и скорости ложного обнаружения белка (FDR) составило 0,01; и было использовано, по крайней мере, 2 подсчета соотношения для LFQ.
Тепловые карты, составленные на основе двухстороннего Т-теста студента, проведенного в Персее, показывают изменение складок и значимость каждого белка клеток HUCPV, инкубированных в течение 11 дней Mg-сплавами (Mg-10Gd, Mg-2Ag и Pure-Mg) по сравнению с контрольными клетками через 11 суток.
Результаты
Состав экстрактов
Cодержание Mg в экстрактах сильно возросло по сравнению со средой экстракции (α-MEM, дополненная 10% сывороткой крупного рогатого скота для мезенхимальных стволовых клеток и 1% антибиотиками пенициллин/стрептомицин при снижении Ca). Чтобы избежать осмотического хока и изучить действие легирующего элемента независимо от содержания Mg, экстракты разводили дифференцирующей средой для получения общей концентрации Mg около 6,08 мММ.
Влияние продуктов распада магниевых сплавов на хондрогенно-дифференцированный протеом HUCPV
Для определения влияния экстрактов Pure-Mg, Mg-10Gd и Mg-2Ag на клетки HUCPV, направленные к хондрогенезу, проводили анализ белков из каждого состояния с помощью дифференциального восходящего протеомика с использованием бесклеточного количественного определения (LFQ).
Под влиянием экстрактов и сгруппированных на тепловой карте 246 значительно регулируемых белков были обнаружены. 136 белков регулировались в присутствии Mg-10Gd, Mg-2Ag и Pure-Mg (из которых 134 белка были обычными для трех экстрактов) в то время как 110 белков были дерегулированы. Для каждого белка из списка регулируемых белков была выполнена аннотация Gene Ontology (GO), загруженная из UniProt. Кластеризация этих белков относительно их локализации в клетках показала, что количество повышающих регуляцию внеклеточных белков и мембранных белков (участвующих не только в составе ECM) в присутствии Mg сплавов было значительно выше, чем в дерегулированных. Кроме того, количество регулируемых цитозольных белков было высоким. Цитозолические и цитоскелетные белки были в основном дерегулированы. Наибольшее количество регулируемых белков было связано с связыванием, дифференцировкой, апоптозом и пролиферацией клеток. В меньшей степени на белки, вовлеченные в ангиогенез, энергетический обмен, развитие костей и хондрогенез, оказывали влияние экстракты.