Материалы
Желатин крупного рогатого скота, изоэлектрическая точка 5,0 была приобретена у Acros Organics. Коконы B. mori шелкопряда, использованные в исследовании, были пожертвованы Сидзя Мином из Чжэцзянского университета. NT была приобретена у Sigma- Aldrich. Все остальные химические вещества были аналитического качества и использовались без дальнейшей переработки.
Подготовка раствора SF
Вкратце, коконы шелкопряда B. mori были нарезаны на мелкие кусочки и варились в водном растворе Na2CO3 в течение 1 часа, а затем несколько раз промывались двойной дистиллированной водой (DDW) для удаления белков серицина из шелковых волокон. Экстрагированный SF высушивали в печи при 60 °C в течение 12 ч, а затем растворяли в водном растворе 9,3 M LiBr при 60 °C в течение 5 ч для получения 5% раствора. Затем регенерированный раствор SF диализовали в трубке из целлюлозы против деионизированной воды в течение 72 ч с несколькими изменениями деионизированной воды для удаления LiBr. Раствор собирали путем центрифугирования, после чего концентрацию определяли гравиметрически после сублимирования раствора SF. Восстановленный 3,5% SF хранился при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
Подготовка микросфер G
10 мл 10% раствора G, предварительно нагретого при 50 °C в течение 1 часа, было добавлено в 100 мл оливкового масла при 400 об/мин механической мешалкой для приготовления водонефтяной эмульсии. Эмульсию погружали в ледяную ванну для поддержания температуры ниже 10 °C и перемешивали непрерывно в течение 20 минут для полного застудневания G в водной фазе. После добавления 30 мл охлажденного ацетона эмульсию перемешивали непрерывно в течение 1 ч. Полученные микросферы G собирали путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин при 25 °C и промывали трижды ацетоном и один раз изопропиловым спиртом. Микросферы G погружали в водный раствор глутаральдегида весом 2,5 % массы в течение 12 часов при температуре 4 °C. Деионизированная вода использовалась для промывки сшитых микросфер. Сшитые микросферы суспендировали в 50 мм глициновом растворе при температуре 25 °C в течение 2 ч для блокировки нереагировавшего остаточного глутаральдегида. Затем микросферы промывали деионизированной водой. После погружения микросфер в деионизированную воду при температуре 25 °C в течение 2 ч микросферы подвергались сублимационной сушке в течение 24 ч для удаления остатков растворителя.
Подготовка ГМ, пропитанных НТ (НТ/ГМ)
Микросферы NT/G были получены путем добавления 4 мкл раствора NT (25 мг/мл) на 1 мг сублимированных микросфер G и последующего хранения при 4 °C в течение ночи. Микросферы поглотили весь раствор NT, поскольку объем раствора был значительно меньше объема насыщения при набухании, поэтому эффективность инкорпорации NT в микросферы G рассматривалась как 100%. Затем композитные микросферы подвергались сублимационной сушке в течение 24 ч для удаления оставшегося растворителя.
Подготовка правки SF, NT/SF и NT/GMs/SF
Концентрация SF составляла почти 4% (в/в), что определялось гравиметрически после сублимационной сушки в течение 24 ч для удаления оставшегося растворителя. Производимая SF повязка заключается в том, что SF раствор заливается в 24-х лунку и сублимируется в течение 24 ч. NT/SF повязку изготавливали путем смешивания 1 мл 4% (ш/в) SF раствора и 4 мкл раствора NT, а затем аналогично SF повязку по протоколу. Заправка NT/GMs/SF производилась путем смешивания 1 мл 4% раствора SF и 10 мг раствора NT/GMs, а затем как SF производилась. Все перевязки погружали в 90% водный раствор метанола на 30 мин для получения нерастворимой в воде заправки.
Опухоль ГМ-ов
Чтобы рассчитать содержание влаги в ГМ, мы должны знать степень набухания. Высушенные и влажные, которые насыщались деионизированной водой в течение 4 ч при комнатной температуре, ГМ наблюдались под микроскопом. Было просмотрено сто сухих и влажных ГМ соответственно. Их диаметр измерялся микроскопом.
Сканирующая электронная микроскопия
Морфология повязок SF, NT/SF и NT/GMs/SF характеризовалась методом сканирующей электронной микроскопии. Размеры пор каждой повязки оценивались путем измерения 25 случайных пор в изображениях SEM и анализа программным обеспечением ImageJ.
Модель для животных
В работе использовались самцы крыс Sprague-Dawley (200-230 гр.). Животные содержались при нормальной комнатной температуре (22-24 °C) в течение 12-часового светового/темного цикла с бесплатным доступом к коммерческому пеллетному питанию и воде. После ранения животных держали в индивидуальных клетках. Все процедуры на животных были одобрены комитетом по управлению экспериментальными животными Университета Сан-Ят-Сен.
Диабетик был вызван однократным внутрибрюшинным введением стрептозоцина в цитратный буфер рН 4,5. Через четыре дня после индукции диабета уровень глюкозы в крови проверяли с помощью глюкометра. Животные с уровнем глюкозы в крови выше 300 мг/дл считались больными диабетом. Крыс обезболивали путем внутрибрюшинного введения ксилазина и кетамина.