У млекопитающих есть четыре гликозилированных гонадотропных гормона (GPH), которые вырабатываются в передней части гипофиза, три из которых участвуют в репродукции. Это - хорионический гонадотропин (ХГ), который вырабатывается в развивающемся концепте, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ). Четвертый гормон - это гормон, стимулирующий щитовидную железу (TSH).
Кристаллическая структура hCG (1HCG) была решена в 1994 году и FSH (1FL7) в 2004 году. В комплексе с гормоносвязывающей частью его рецептора FSHR. Структуры ЛГ и ТТГ не определены. Хотя четыре полипептидных гормона имеют только около 35% идентичности последовательности, кристаллические структуры, наряду с другими доказательствами, подтверждают, что общие структуры четырех гормонов, которые, очевидно, произошли из общего гена, очень похожи.
GPH активно существуют в виде гетеродимеров, состоящих из общей α-субъединицы и уникальной β-субъединицы, которая придает рецепторную специфичность. Структура общей α-субъединицы известна из предыдущих кристаллографических анализов. Как α-, так и β-субъединицы GPH принадлежат к семейству полипептидов цистеин-узелкового фактора роста.
Все β-субъединицы содержат шесть дисульфидных мостиков, которые блокируют бета-нити в центральном негидрофобном ядре с соответствующими гибкими внешними петлями. Гормоны имеют необычно высокое отношение поверхности к объему с минимальным гидрофобным ядром, и они сильно гликозилированы, каждый по-своему.
После удаления сигнального пептида из 20 аминокислот длина β-субъединиц GPH составляет hCG - 145 аминокислот, FSH - 109 аминокислот, LH - 121 аминокислоту и TSH - 112 аминокислот. Субъединица α во всех гормонах имеет длину 92 аминокислоты и содержит пять дисульфидных связей.
β -субъединица LH, которую кристаллизовали из PEG в присутствии β-октилглюкозида и трипсина, была частью белкового препарата. Который был первоначально секвенирован. Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны в SLAC в 1999 году, но решение кристаллической структуры ускользало до недавнего времени. Используя алгоритмы и программы, разработанные за последние двадцать лет, ученые смогли решить структуру путем молекулярного замещения с использованием ХГЧ (1HCN) (Wu et al., 1994) в качестве поисковой модели и уточнить структуру с использованием максимального правдоподобия.
Разрешающая способность данных, которая достигла предела дифракционной картины (соответствует общему тепловому коэффициенту около 125 Å 2), является относительно низкой по сравнению с текущими определениями структуры. Следует также отметить, что в дополнение к 10% остатков, представляющих собой цистеины, участвующие в дисульфидных связях, еще 20% остатков представляют собой пролины, иногда в виде множественных пролинов на коротких отрезках.
Это был лиофилизированный белый порошок, который поддерживался при -20 ° С. В 1998 году были получены маленькие пластинчатые кристаллы. 30 мг/мл раствора белка в 0,10 М цитрате натрия при рН 5,8 и 1% β-октилглюкозида (BOG) инкубировали при 37°С в течение 24 ч с 0,1 мг/мл бычьего трипсина.
Затем белок кристаллизовался при 4°С в течение нескольких недель путем диффузии паров в капле против 0,6 мл резервуаров в чашках Cryschem (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), состоящих из 20% вес/объем PEG 3350 и 1% BOG, забуференных 0,10 М цитратом натрия при pH 5,8. Капли имели объем 6 мкл, состоящий из равных объемов раствора белка, все еще содержащего трипсин и BOG, с раствором резервуара.
Данные собирали по линии луча 7.1 в SLAC с помощью детектора CCD MAR, обрабатывали и масштабировали с использованием программы d*Trek (Pflugrath, 1999). Кристаллы имели пространственную группу F222, не сплетенные в соответствии с L-тестом, с размерами ячеек a = 80,02 Å, b = 80,02 Å, c = 206,13 Å и дифрагированный до примерно 3,0 Å. Кристаллы имели псевдопространственную группу I4 1 22 с a = b = 56,57 Å, с = 206,13 Å.
Используя в качестве поисковой модели β-субъединицу хорионического гонадотропина человека, выделенного из записи PDH 1HCN из банка данных белка (Bernstein et al., 1977 ), и программы PHASER ( McCoy et al., 2005, McCoy et al., 2007) в качестве асимметричной единицы кристаллов были обнаружены две копии β-субъединицы LH, связанные двойной осью NCS.
Белки были перестроены в соответствии с аминокислотной последовательностью LH β [Uniprot P04651-LSHB_BOVIN], а сдержанное уточнение с добавлением ограничений TLS было выполнено с использованием программы REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) программной системы CCP4. Ограничения NCS были сохранены повсюду. Построение модели, вычисление карт Фурье и разностных карт Фурье, суперпозиция моделей и валидация модели выполнялись с помощью программы COOT (Emsley and Cowtan, 2004).
В структуре асимметричной единицы двух β-субъединиц LH очевидно наличие двойной симметрии NCS. Также присутствовали олигосахариды, ковалентно связанные с аспарагином 13, и две молекулы β-октилглюкозида, неионного детергента.
Хотя на редкость и согласуется с включением трипсина в кристаллизацию, ни одна из двух белковых молекул не является полностью интактной, хотя почти все их аминокислоты присутствуют в структуре. Обе молекулы содержат непрерывный участок от аминоконца, серина 1, до цистеина 100, который связан дисульфидной связью с цистеином 93.
Затем происходит разрыв в полипептидной цепи между цистеином 100 и глицином 101. Карбоксильный концевой фрагмент представляет собой однако не теряется, поскольку содержит цистеин 110, который остается связанным с цистеином 26 дисульфидным мостиком. Таким образом, цепь от gly101 до ile118 присутствует, но явно не отражает ее расположение в интактной β-субъединице. На второй молекуле в асимметричной единице только аминокислоты gly101-asp111 являются очевидными в электронной плотности.
В большинстве случаев необычно, что олигосахариды гликопротеина хорошо упорядочены, но здесь это было не так. На одной молекуле было видно семь остатков сахара, которые соответствовали ожидаемому расположению, а на другой молекуле пять сахаров. В структуре зонда присутствовал только начальный NAG, связанный с asn.
В асимметричной единице олигосахариды двух молекул тесно связаны и даже вступают в контакт друг с другом, что может объяснить их устойчивые конформации. Предсказанные два дополнительных сахара, манноза и терминальная сиаловая кислота, не присутствуют в электронной плотности и, вероятно, не разупорядочены, но, скорее всего, отсутствуют. Если бы они присутствовали, вероятно, произошло бы столкновение с молекулами, связанными с симметрией в решетке.
Олигосахариды находятся на противоположной стороне β-субъединицы, от которой ожидается взаимодействие с α-субъединицей. Следовательно, олигосахариды не будут взаимодействовать или связываться с α-субъединицей, когда связаны. Субъединицы α и β схожи по трехмерной структуре, причем обе представляют собой «цистеиновые узлы» с удлиненными петлями. Ассоциация β-субъединиц в этой асимметричной единице, однако, никоим образом не похожа на организацию α- и β-субъединиц в ХГЧ или ФСГ.
Модель асимметричной единицы, помещенной в PDB, имеет отклонения длины связи 0,009 Å, отклонения угла связи 1,80 ° и 0,084 Å 3 отклонения для киральных центров. Нет никаких выбросов ротамеров (хотя 4 находятся в диапазоне низких вероятностей), и есть 10 выбросов Ramachandran (5 на молекулу), с 80% в разрешенных областях и 34 в разрешенных областях согласно COOT.
Число Ramachandran выбросов и краевых углов phi/psi кажется повышенным, но молекула необычна. Как отмечено выше, 10% его остатков представляют собой цистеины, связанные дисульфидными связями, и 20% оставшихся остатков представляют собой пролины. Таким образом, не удивительно, что необычные Ramachandran углы нередки.
Сравнение геометрии β-модели LH с моделями PDB для hCG (1HCN) и FSH (1FL7) показывает, что эта β-модель LH фактически является улучшением с точки зрения геометрии.