Долгий путь к открытию
Инновационный подход к калибровке высокотехнологичных микроскопов позволяет исследователям отслеживать движение отдельных молекул в 3D в наномасштабе.
Исследовательская группа Стэнфордского университета во главе с В.Е. Мернером продолжает работу, которая принесла Мернеру и его коллегам Эрику Бетцигу и Штефану В. Аду Нобелевскую премию по химии 2014 года. Бетциг и Мернер стали первопроходцами в разработке визуализации сверхвысокого разрешения, которая впервые нарушила дифракционный предел оптической микроскопии, использовав флуоресценцию отдельных молекул. Новая работа демонстрирует заметное улучшение точности этой технологии визуализации и отслеживания молекул в трех измерениях.
Отслеживание того, как молекулы перемещаются, формируют и взаимодействуют внутри клеток и нейронов организма, предлагает новый мощный взгляд на ключевые биологические процессы, такие как оповещение, деление клеток и нейронное взаимодействие, которые влияют на здоровье людей и чувствительность к заболеваниям.
Использование преимуществ трансформации в микроскопии
В микроскопии сверхвысокого разрешения используются лазеры для возбуждения флюоресценции от отдельных молекул в условиях, когда лишь несколько одновременно испускается, преодолевая традиционный предел разрешения для оптической микроскопии, установленный пределом дифракции света.
"С появлением изображения сверхвысокого разрешения мы улучшили разрешение в 5-10 раз выше дифракционного предела - с 200 нанометров до 40 или даже 10 нанометров", - сказал Мернер. "Этот новый мир с значительно увеличенным разрешением привносит большие изменения в работу оптической системы."
Однако предыдущие методы калибровки для микроскопии сверхвысокого разрешения не были достаточно точными для 3D измерений отдельных молекул. Новый метод калибровки использует нано-дырочную решетку для коррекции оптических искажений во всем поле зрения широкопольного микроскопа.
Устранение искажений
При визуализации в масштабе отдельных молекул одна точка света, исходящего от молекулы, обычно может быть расположена с точностью до 10 нанометров. При таком высоком разрешении любые мелкие дефекты в оптической системе вносят искажения в изображение или искажения, которые могут значительно исказить результаты измерений, особенно в 3D. Получившиеся ошибки могут означать разницу между интерпретацией двух молекул как взаимодействующих или просто находящихся рядом друг с другом.
В то время, как многие используют флуоресцентные бусины для калибровки 3D микроскопов, Алекс фон Дизманн, работник лаборатории Moerner Lab Стэнфордского университета, выбрал другой подход. Он создал ряд отверстий в металлической пленке, каждое размером менее 200 нанометров и регулярно расположенных на расстоянии 2,5 мкм друг от друга, для использования в качестве эталона 3D калибровки. Как только отверстия были заполнены флуоресцентными красителями, массив можно было использовать для калибровки оптических ошибок по всему полю зрения микроскопа, а не только в нескольких выбранных точках, как это возможно при использовании флуоресцентных бусин. Используя эту методику, исследователи смогли откорректировать отклонения от 50-100 нанометров до 25 нанометров.
Исследователи изучили новую методику калибровки с использованием функций двойной спирали и астигматического точечного распространения, два типа оптических модификаций, которые обычно используются для определения местоположения оси Z. Хотя обе функции распределения по осям z показали погрешности, связанные с осью z, что привело к 20-процентной погрешности в 3D измерениях, исследователи исправили эти погрешности с помощью 3D наностволовой матрицы.
Демонстрация преимуществ исследования белков бактерий в бактериях
В настоящее время исследователи применяют новую методику 3D калибровки для всех своих исследований в области наблюдения мономолекул и микроскопии сверхвысокого разрешения. Например, фон Дизманн использует его для изучения локализации белка в бактериях, длина которых составляет всего два микрона. С помощью технологии 3D калибровки он может точно измерять и отслеживать ключевые сигнальные белки в нанодоменах размером от 150 до 200 нанометров.
Исследователи отмечают, что коррекция полевых и других типов отклонений становится все более важной по мере развития технологий оптической микроскопии, например, для углубления изображения в клетки.
Исследователи создали инструмент 3D калибровки, создав ряд наноразмерных отверстий, заполненных флуоресцентным красителем. Широкопольная подсветка (зеленая) проходит через стеклянное покровное стекло в нанослойное отверстие, протравленное в слой алюминия. Раствор флуоресцентного красителя заполняет отверстия, и снизу обнаруживаются точки попадания света (оранжевый).