Мы исследовали клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых биндарит, небольшое производное индазола, обладающее выраженным противовоспалительным действием, показывает свою иммунорегуляторную активность в стимулированных липополисахаридом (LPS) человеческих моноцитарных клетках. Мы обнаружили, что биндарит дифференциально регулирует высвобождение интерлейкина-8 (IL-8) и белка-1 хемоаттрактанта моноцитов (MCP-1), усиливая высвобождение IL-8 и уменьшая высвобождение МСР-1. Эти эффекты, в частности, требовали функционального взаимодействия между биндаритом и белком, связывающим жирные кислоты (FABP4), липидным шапероном, который связывает внутриклеточные липидные медиаторы с их биологическими мишенями и сигнальными путями. Мы также продемонстрировали, что биндарит может напрямую взаимодействовать с FABP4 путем увеличения его экспрессии и ядерной локализации, таким образом воздействуя на γ-рецептор, активируемый пролифератором пероксисомы (PPARγ), и на передачу сигналов LPS-зависимой киназы. Взятые вместе, эти результаты предполагают потенциальную ключевую роль FABP4 в иммуномодулирующей активности биндарита и расширяют спектр его возможных терапевтических применений для модуляции FABP4.
Введение
Биндарит [2 - [(1-бензилиндазол-3-ил) метокси] -2-метилпропановая кислота] представляет собой синтетическое индазольное производное с выраженной противовоспалительной активностью, которое, как было показано, является безопасным и особенно эффективным при лечении нескольких экспериментальных воспалительные и аутоиммунные нарушения, от вирусного и адъювантного артрита до острого панкреатита, диабетического нефрита и аутоиммунного энцефаломиелита . Такой спектр активности обусловлен со способностью биндарита ингибировать выработку определенного набора родственных хемокинов с CC-мотивом, прежде всего MCP-1, и, таким образом, препятствовать рекрутированию и дифференцировке моноцитов.
Предыдущее исследование идентифицировало модулирующее действие биндарита на сигнальный путь ядерного фактора -κB (NF-κB) в макрофагальной клеточной линии, где биндарит специфически ингибировал p65 и p65 / p50-опосредованную активацию промотора MCP-1 . Однако, механистические детали этого действия остались неисследованными.
Здесь мы использовали человеческие миелоидные клетки MonoMac-6 (MM-6) для опроса молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе иммуномодулирующей активности биндарита в отношении экспрессии LPS-индуцированных MCP-1 и IL-8. В частности, дополняя in silico , биохимический и визуальный подходы, мы оценили возможное участие FABP4 и PPARγ. В самом деле, перекрестные переговоры между этими двумя белками участвуют в передаче сигналов биологически активного липида и, в частности, в регуляции экспрессии IL-8 и MCP-1 в моноцитах и макрофагах .
Биндарит избирательно усиливает экспрессию FABP4
Вероятной молекулярной мишенью биндарита является FABP4, небольшой цитозольный белок, ответственный за внутриклеточный транспорт жирных кислот как в адипоцитах, так и в макрофагах, где он является основным регулятором экспрессии MCP-1. Мы предположили, что биндарит может мешать выработке МСР-1, функционально ингибируя активность FABP4. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала оценили влияние биндарита на экспрессию FABP4. Сам по себе LPS не изменил ни экспрессию FABP4, ни экспрессию других носителей (Fig.). Неожиданно было обнаружено, что биндарит вызывает значительное повышение уровней FABP4 в LPS-стимулированных моноцитарных клетках (Fig. ). Примечательно, что этот эффект специфичен для FABP4, поскольку биндарит не влиял на экспрессию FABP5, другого члена семейства FABP, экспрессируемого в моноцитах , и на действие других белков, участвующих во внутриклеточном транспорте липидов в моноцитах / макрофагах, таких как альбумин. , белок теплового шока 70 кДа (Hsp70) и белок, активирующий 5-липоксигеназу (FLAP).
FABP4 участвует в механизме действия биндарита
Дальнейшее исследование роли FABP4 в иммуномодулирующей активности биндарита было проведено с BMS309403, сильным и селективным ингибитором FABP4 . BMS309403 per se не смог изменить вызванное LPS высвобождение IL-8, хотя он полностью обратил опосредованную биндаритом сверхэкспрессию IL-8 (Fig. ; P <0.01). Кроме того, только BMS309403 сильно уменьшал опосредованное LPS высвобождение MCP-1, которое полностью стиралось при совместном введении BMS309403 с биндаритом.
Биндарит физически взаимодействует с FABP4
Чтобы установить возможную физическую связь между биндаритом и FABP4, были проведены конкурентные анализы связывания, в которых увеличивающиеся концентрации биндарита были использованы для замещения радиоактивно меченных жирных кислот, связанных с FABP4. Было показано, что биндарит способен полностью замещать [ 3 H] -олеиновую кислоту и [ 3 H] -арахидоновую кислоту со значениями Ki, равными 19 ± 3 мкМ и 60 ± 17 мкМ соответственно.
После каждой обработки клетки MM-6 (10 5клеток / мл) высевали на стеклянные покровные стекла в 12-луночные планшеты и фиксировали 3% параформальдегидом, содержащим 4% сахарозы, в PBS в течение 20 минут. Затем клетки промывали PBS и пермеабилизировали в течение 10 минут PBS, содержащим 5% бычьего сывороточного альбумина, 0, 1% NP-40 и 0, 5% сапонина. Иммунодетекцию FABP4 осуществляли путем инкубации клеток с первичным антителом кролика против FABP4, разведенным 1: 200 в PBS. После инкубации с первичным антителом в течение 3 часов клетки промывали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с вторичным антителом козы кролика, конъюгатом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), разведенным 1: 200 в PBS. Затем клетки окрашивали DAPI, устанавливали с помощью Prolong Gold Diamond (Молекулярные зонды) и отображали с помощью конфокального микроскопа LSM 400 (Zeiss, Oberkochen, Germany), оборудован HCX план апо 63X (числовая апертура 1. 4) масляный иммерсионный объектив. Зеленая флуоресценция возбуждалась с использованием лазерной линии 488 нм, а соответствующее излучение флуоресценции регистрировалось с помощью полосового фильтра 580–620 нм, тогда как DAPI возбуждался с помощью специального УФ-диода 405 нм и излучал свет, отфильтрованный с помощью щелей для спектрального разделения (415–490 нм). Каждое изображение было получено на экваториальном плане клеток с использованием программного обеспечения ZEN (Zeiss). В целях презентации изображения экспортировались в формате TIFF и обрабатывались с помощью Artstudio Pro версии 2. 0. 13 для macOS и испускал свет, отфильтрованный с использованием щелей спектрального разделения (415–490 нм). Каждое изображение было получено на экваториальном плане клеток с использованием программного обеспечения ZEN (Zeiss). В целях презентации изображения экспортировались в формате TIFF и обрабатывались с помощью Artstudio Pro версии 2. 0. 13 для macOS и испускал свет, отфильтрованный с использованием щелей спектрального разделения (415–490 нм). Каждое изображение было получено на экваториальном плане клеток с использованием программного обеспечения ZEN (Zeiss). В целях презентации изображения экспортировались в формате TIFF и обрабатывались с помощью Artstudio Pro версии 2. 0. 13 для macOS, для регулировки яркости и контрастности. Для анализа изображений для каждого образца были получены данные из изображений с высоким разрешением 15 ячеек из 2 независимых экспериментов. Количественное определение средней ядерной и цитозольной флуоресценции FABP4 проводили с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Фосфор-МАРК массив антител Профиль или фосфорилирование белка в необработанном и обработанном клеточном лизате проводили с использованием массива человеческих фосфо-MAPK-антител номер по каталогу ARY002), следуя инструкциям производителя. Белковые пятна визуализировали с использованием реагентов для определения хемилюминесценции, поставляемых в наборе. Показатель интенсивности каждого дублированного пятна массива регистрировался блот-сканером C-DiGit и анализировался в Image Studio Software, а усредненная интенсивность рассчитывалась путем вычитания усредненного фонового сигнала. Изменение кратности было получено путем сравнения образцов с образцом, обработанным LPS (установленным на 1). статистический анализ Данные, представленные в этой статье, представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) по меньшей мере двух независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в двух или трех экземплярах.
статистический анализ
Данные, представленные в этой статье, представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) по меньшей мере двух независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в двух или трех экземплярах. Р <0,05 было выбрано для установления значимости. Все измерения были построены и проанализированы с использованием GraphPad Prism версии 6.00 для macOS (программное обеспечение GraphPad).