В середине XIX в. Луи Пастер установил, что определенные химические реакции идут в присутствии живых клеток; он показал, что дрожжи, с помощью которых углеводы сбраживаются до этилового спирта и двуокиси углерода, представляют собой живые клетки. В конце века братья Э. и X. Бюхнеры обнаружили, что если к измельченным дрожжевым клеткам добавить углеводы, то они тоже окисляются до спирта и двуокиси углерода. Таким путем они пришли к выводу, что в дрожжевых клетках содержатся вещества, которые катализируют химические реакции. Это открытие определило основное направление развития биохимии.
В течение XX в. Биохимики пытаются понять, как извлеченные из клеток и очищенные вещества могут осуществлять те химические превращения, которые свойственны самим живым клеткам. Исследовались самые различные реакции, и постепенно в путанице событий ученые находили «ниточки» внутриклеточных метаболических путей. Хотя некоторые аспекты метаболизма до сих пор остаются невыясненными, расшифрованные цепи реакций (пересекающиеся, соединяющиеся, циклические) начинают складываться в сложную картину обмена веществ всей клетки. В той мере, в какой живы еще возражения против правомерности современной биохимии, они касаются и вопроса о сведении жизненных процессов к последовательности химических реакций.
Здесь нужно сказать о методе исследования, который помогает ответить на подобные вопросы, позволяя наблюдать протекание реакций прямо в отдельных клетках, тканях, органах и в целом в живых организмах, в том числе в организме человека. Этот метод — спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия). Явление ЯМР основано на том, что ядра с нечетным числом нуклонов (протонов и нейтронов) обладают магнитными свойствами, которые превращают каждое такое ядро в магнитный диполь, имеющий определенную ориентацию. К подобным ядрам относятся, в частности, протоны (1Н), составляющие 99,98% всех атомов водорода в природе, углерод-13 (13С), содержание которого в природе 1,1%, и фосфор-31 (31Р), который составляет все природные атомы фосфора.
В ЯМР-спектроскопии клетки, ткани или органы подвергаются одновременному действию двух полей. Первое — сильное магнитное поле; оно заставляет ядерные диполи (ядра водорода-1, углерода-13 и фосфора-31 в исследуемом образце) ориентироваться таким образом, чтобы каждый диполь был направлен по полю (точнее, вдоль его магнитных силовых линий) или против поля. Ориентированные вдоль направления поля ядра обладают меньшим запасом энергии, чем ядра, ориентированные против поля.
Затем налагают второе поле — электромагнитное излучение в радиочастотной области спектра. Определенной напряженности магнитного поля соответствует определенная частота электромагнитного излучения, при которой каждый фотон (квант излучения) имеет энергию, достаточную для того, чтобы заставить ядра определенного типа совершить «перескок» от ориентации по полю к ориентации против поля. Следовательно, если поддерживать постоянной напряженность магнитного поля и менять его частоту (или наоборот фиксировать частоту, а напряженность поля менять), наступит момент резонанса ядер — они будут поглощать кванты радиоизлучения.
Например, в магнитном поле напряженностью 84 ООО Гс резонанс на ядрах 1Н происходит при частоте - 360 МГц, на ядрах 31Р — при частоте ~ 146 МГц, на ядрах 13С — при частоте - 90 МГц. В клетках, тканях и живых организмах частота резонанса зависит еще и от химического окружения данного ядра. Поскольку ядра входят в состав атомов, а из атомов построены молекулы, частота имеет «химический сдвиг», т. е. отличается от той, при которой осуществлялся бы резонанс изолированного ядра.
Рассмотрим спектр ЯМР глутаминовой кислоты, представляющей собой серию пиков (линий поглощения). Хотя природное содержание углерода-13 составляет лишь 1,1%, в спектре четко видны пики, соответствующие резонансу на ядрах 13С для пяти разных положений этого атома в молекуле. Если спектр получен при изменении напряженности магнитного поля, то эти пики охватывают область приблизительно в 200 миллионных долей, м. д. (0,02% напряженности поля). В молекуле глутаминовой кислоты два атома углерода связаны с двумя атомами кислорода каждый (СОО~), поэтому их пики совмещаются в один. На определенном расстоянии от него находятся пики двух атомов углерода, связанных с двумя атомами водорода, и пик атома углерода, связанного с одним атомом водорода. Наблюдаемый в спектре ЯМР пик можно отнести к определенному атому углерода данной молекулы разными способами, самый прямой из них – метод углеродной «метки», когда спектр записывают после того, как в определенное положение молекулы введен изотоп углерода 13, так что число атомов 13С в данном положении становится намного боле, чем при его естественном содержании.