Поговорим теперь о гомологичной рекомбинации. Этот метод хорош тем, что мы можем использовать донорную молекулу ДНК, которая будет нести в себе все необходимые свойства. Правда есть несколько минусов. Во-первых, это процесс все-таки редкий. Да, мы его стимулируем, однако клетке проще запустить систему репарации по типу негомологичного сшивания концов и как можно скорее починить поврежденный участок. Во-вторых, нам необходимо использовать дополнительный компонент для доставки в клетку (это система молекулярных ножниц и донорная ДНК). Чем больше конструкций мы пытаемся ввести внутрь клетки, тем меньше шансов, что все конструкции туда попадут. Но у нас появляется одно очень важное преимущество. Мы можем вводить мутации вплоть до одного нуклеотида. Это офигенное преимущество. Это значит, что даже дефект в 1 нуклеотид, который приводит к появлению дефектного гена можно исправить и получить в итоге функциональный ген и белок.
Все это звучит красиво и прекрасно. Но как можно проводить селекцию? Как мы можем отобрать те клетки, в которых произошло редактирование? Если нам необходимо поменять один нуклеотид, то мы не можем вводить никакие гены флуоресцентных белков, никакие гены устойчивости к антибиотикам. Как быть? На самом деле все достаточно просто. Мы никуда не можем уйти от использования маркеров, но мы можем их не вводить в геном клетки-хозяина. Чаще всего маркеры используются на молекуле ДНК, несущей в себе молекулярные ножницы. Про это мы поговорим как-нибудь потом, но очень часто молекулярные ножницы являются молекулой ДНК, которая попадает в клетку, а потом синтезирует все что необходимо для осуществления двухцепочечного разрыва. В эту молекулу ДНК можно ввести ген флуоресцентного белка. Эта молекула ДНК не будет встраиваться в геномную ДНК и потеряется после клеточного деления, однако, пока клетка не поделилась, она может синтезировать все компоненты, кодируемые этой молекулой. Если синтезируется флуоресцентный белок, то клетка будет светиться, и мы сможем отобрать все светящиеся клетки. Безусловно, мы не можем быть уверенными, что в этих клетках произойдет редактирование. Мы можем быть уверены в том, что клетка получила необходимые компоненты. Вероятность попадания в клетку зависит от типа клетки. Но чаще всего это 5-10% в лучшем случае. Мы сейчас не говорим о клеточных линиях, где эффективность может достигать 95%. Согласитесь, что работать с клетками, которые содержат все компоненты куда приятнее, чем работать со всей популяцией, где 95% остаются нетронутыми. Если использовать антибиотик, то принцип точно такой же. Выживают только те клетки, где есть ген устойчивости. Соответственно те клетки, которые не получили набор для редактирования погибнут. Через деление эта конструкция так же потеряется и можно будет не переживать о возможном встраивании ее в геном.
В следующий раз расскажу вам о том, какие именно технологии применяют сегодня.