Что будет если разрезать геномную ДНК пополам? Запустится система репарации. Их в клетке несколько. Мы все помним, что у нас двойной набор хромосом. Значит, если повезет и повредится ДНК только на одной хромосоме, то вторую можно использовать в качестве донорной для исправления бреши. Этот процесс называется гомологичной рекомбинацией, о которой я немного рассказывал в первой части истории. Есть еще один способ репарации. Называется репарация по типу сшивания негомологичных концов “Non-Homologus-End-Joining”- NHEJ. Здесь все куда интересней. Клетка старается заделать брешь как-нибудь. Если повезет, то оба конца молекулы ДНК сомкнутся без проблем. Куда чаще бывает и наоборот (хотя это спорный вопрос насчет частоты). Происходит внесение дополнительных нуклеотидов (инсерции) или удаление (делеции). Этот процесс неуправляем и мы не можем предугадать которое из этих событий произойдет. Например, если мы возьмем клетки, сделаем во всех клетках в одном и том же месте двухцепочечный разрыв, а потом все проанализируем, то мы можем увидеть, что часть клеток содержат неповрежденную молекулу ДНК, у части есть инсерции в 1-10 нуклеотидов, у части делеции в 1-10 (а то и больше) нуклеотидов.
По большому счету, если у нас задача выключить какой-либо ген, то нас устроит практически любой исход, если количество нуклеотидов меняется. Бывает, кстати, и еще более интересная ситуация. Количество нуклеотидов может остаться тем же самым, однако последовательность будет другая. Тут уже надо детально изучать эту последовательность, чтобы делать какие-нибудь выводы.
Как именно ломается ген? Я думаю, что вы помните, что ген - последовательность, нуклеотидов, задающая последовательность определенного полипептида или функциональной РНК. Аминокислотная последовательность записана в гене определенным способом. В виде триплетов (кодонов, три нуклеотида подряд). Каждому триплету соответствует одна аминокислота. Соответственно, если мы найдем на последовательности ДНК начало гена и конец, то мы сможем “прочитать” всю последовательность. Начало гена всегда старт кодон (аминокислота метионин) - ATG. Конец - один из трех кодонов (TAA, TAG, TGA). Вот эта последовательность, начиная от старт-кодона до стоп-кодона называется открытой рамкой считывания. Несложно догадаться, что последовательность нуклеотидов должна быть кратна трем. Введение 1 или 2 нуклеотидов приведет к сбою рамки считывания, в результате чего нарушится аминокислотная последовательность и ген поломается. Синтезируемый белок будет дефектен. Возможно он вообще не станет синтезироваться. А если встроится или удалится 3 нуклеотида? В данном случае рамка считывания останется неизменной, но в целевом белке будет присутствовать или отсутствовать аминокислота. Нельзя сказать к чему это приведет. Если эта мутация будет в активном центре, то скорее всего белок потеряет свои свойства. Если мутация будет в незначимой части, то скорее всего на функциональность белка это никак не повлияет. Собственно поэтому, все кто занимается редактированием генома не любят инсерции/делеции в 3 нуклеотида.
Как я уже говорил, такие поломки нужны для того, чтобы сломать какой-нибудь ген. Это еще называют нокаутом. Не путать с нокдауном - это временное отключение гена. Нокаут - постоянное. В 99% случаев это чисто прикладная задача, которая используется в лаборатории, однако не исключаю, что и практическое применение можно этому найти.
Гомологичная рекомбинация более длительный процесс. Даже при наличии донорного фрагмента ДНК клетка скорее всего будет запускать процесс NHEJ.Для клетки проще залатать дырку по типу NHEJ, однако если ген значимый и клетка не смогла его починить, то она просто погибнет, а выживет лишь та, которая смогла сделать все как надо. Как говорил раньше, для гомологичной рекомбинации часто используют маркеры. Это действительно так, однако есть ряд особенностей. Об этом я расскажу в третьей части.