Использование органных зоокультур является уникальным и вместе с тем широко применяется в настоящее время, как в практических, так и в научных исследованиях. Это обусловлено, в первую очередь, созданием адекватных питательных сред, ферментов для разделения тканей, антибиотиков, выделению факторов роста, созданию целой индустрии производства культуральной посуды и установок для выращивания клеток.
Все это позволило получать не только перспективные линии клеток человека и животных, широко использовать их в научных исследованиях, но и создавать на их основе новые современные технологии производства. Число линий клеток постоянно растет, часто клетки внешне трудноотличимы. Они имеют сходную морфологию и ростовые свойства. Наличие нескольких линий клеток в лаборатории, особенно занимающихся получением собственных культур, создает предпосылки не только для загрязнения клеток посторонними микроорганизмами, н о и контаминации клеток клетками других линий. Использование культур клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых результатов. Эти данные подчеркивают чрезвычайную важность создания специализированных коллекций культур клеток и характеризации поступающих и вновь получаемых культур клеток, используемых в научных или прикладных исследованиях.
Современные питательные среды позволяют не только культивировать многие уникальные типы клеток в системе in vitro, но и производить достаточно большие количества продукта в клетках при масштабном их культивировании. Благодаря способности вирусов размножаться и вызывать цитопатогенное действие в культивируемых соматических клетках, культуры клеток получили широкое распространение в проведении вирусологических исследований и производстве вакцинных или диагностических препаратов. Чрезвычайно важной оказалась возможность использования клеток животных для получения генно-инженерных препаратов. Например, именно правильное гликозилирование и полноценная «сборка» полипептида эритропоэтина (ЭПО) сделали культуру клеток СНО-рЕ, выделенную из яичников китайского хомячка, высокоперспективной для производства генно-инженерного ЭПО с высокой биологической активностью in vivo. Стабильность производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики или лечения в значительной мере зависит от стабильности свойств и безопасности используемых клеток. Для контроля клеток, как субстратов для применения в производстве или лечения, разработаны и узаконены как национальные, так и международные требования.
Согласно этим требованиям, система создания посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями, а также создание условий производства в соответствии с правилами GLP и GMP является обязательным и обеспечивает, главным образом стандартность и безопасность клеток, и спользуемых в производстве медицинских иммунобиологических препаратов. Уникальным и перспективным представляется совершенно новое направление применения клеток для регенеративной медицины. Замена больного органа на «здоровый» путем трансплантации, несомненно, имеет свои преимущества, однако ограниченность в наличии жизнеспособных органов и необходимость ожидания органа иногда приводят к необратимым последствиям.
В таком случае трансплантация клеток может стать альтернативным методом спасения больных как с острой недостаточностью органов (печени, почек, поджелудочной железы и др.), так и при их нарушении (ожоговые и трофические раны) или функциональных недостатках органов и тканей (миодистрофия Дюшенна, болезнь Альцгеймера, паркинсонизм, инфаркт миокарда и др.). Успешное применение трансплантации клеток показано как в моделях на животных, так и в медицинской практике. Несомненна эффективность метода при лечении болезней сердца, мышечных тканей или эндокринных органов.
1 Получение и культивирование клеток человека и животных
Первые попытки культивирования кусочков ткани в виде органных культур относятся к началу прошлого века, а культивирование отдельных клеток не удавалось. Основной причиной неудач было отсутствие адекватной питательной среды. Начало успешного развития метода культивирования отдельных клеток следует отнести к 1941 г., когда W. R. Earle вывел первую перевиваемую линию мышиных клеток L, широко распространенную до настоящего времени в клональном варианте L929 (NCTC 929). Именно в это время были разработаны способы ферментативного диспергирования тканей и получения однослойных культур клеток, сконструированы первые адекватные и сравнительно доступные питательные среды.
Введение антибиотиков принципиально расширило возможность борьбы с бактериальной контаминацией. В результате исследователи смогли регулярно и с высокой эффективностью получать первичные, а затем перевиваемые клеточные культуры.
Успех культивирования первых во многом обусловлен наличием адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект «заякоривания» на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика рост клеток происходит в виде монослоя. Однако они не растут в суспензионных культурах.
Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хорошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии [4].
Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами.
В настоящее время появилась еще одна группа культур тканей – речь идет о клетках, полученных методами генной инженерии или другим методом современной биотехнологии и требующих специальных условий культивирования [2].
2 Системы культивирования клеток животного и человека
Системы культивирования животных клеток и тканей делят на 2 группы: 1 группа – монослойные, когда клетки развиваются на поверхности стекла и пластика (бутылок, матриц) или поверхности специальных носителей, погруженных в питательной среде. Культура клеток выращивается в виде монослоя, в виде однослойной стационарной культуры. 2-я группа – суспензионные культуры, когда клетки растут свободно (подобно микроорганизмам) в суспензии.
Для крупномасштабного получения суспензионных культур необходима промышленная аппаратура, соответствующая двум главным требованиям: конструкция должна быть рациональной, обеспечивающей интенсивное перемешивание среды; кроме того, клетки должны находиться в щадящих условиях. Не всегда легко соблюсти оба требования.
Для управляемого реактора культивирование клеток наиболее удобным является суспензионный метод. Данный метод требует наиболее однородного условия для культивирования тканей, близких к тем, которые создаются при выращивании микроорганизмов.
Используя культивирование клеток в суспензии, можно получить большой выход клеток на единицу объема среды при обильной подаче питательных веществ. Однако к такому типу культивирования удовлетворительно адаптируются не все клетки, а лишь трансформированные, такие как Hela, кВ, ВИК-21 и др., а также лейкоцитарные культуры [1].
Для культивирования животных клеток используют те же технические средства, которые применяют для культивирования микроорганизмов. Однако в этих случаях добиваются того, чтобы в биореакторах не происходили механические повреждения животных клеток, которые менее прочны, чем микроорганизмы. Внутренняя поверхность реактора должна быть гладкая, а механические мешалки не должны создавать сильную турбулентность среды. Большинство клеток требует поверхности для своего роста.
Чтобы повысить концентрацию клеток в биореакторе, практикуют отделение клеток от среды при помощи мембран. Необходимо учитывать, что размеры животных клеток составляют примерно 5-10 мкм (размеры большей части бактерий около 0,5-3 мкм).
Чтобы интенсифицировать процесс получения продуктов с использованием клеток животных, необходимо создать биореакторы, в которых можно было бы повысить концентрацию клеток на два порядка. Для этого практикуется адсорбция клеток поверхности полых волокон или флокуляция при помощи специальных флокулянтов. Наиболее широко применяются для культивирования животных клеток шарообразные микроносители из стекла, синтетических полимеров или декстрана с частицами размеров 200500 мкм.
Для крупномасштабного культивирования клеток используют роллерное культивирование: выращивание клеток производят на стенке цилиндрических вращающихся сосудов в виде монослоя в роллерно-бутылочных аппаратах, помещенных в термостатируемые камеры. Такие аппараты широко используются в производстве вакцин, число бутылок в каждой установке достигает 700, объем сотни литров.
Роллерные культуры просты, надежны, экономичны. При выращивании клеток центральной проблемой остается повышение эффективности использования компонентов среды, продуктивность клеток, увеличения доступной для роста клеток поверхности в расчете на единицу объема питательной среды [3].
Роллерные культуры имеют значительные преимущества по сравнению со стационарными при том же количестве питательной среды. Площадь, занимаемая клетками, по крайней мере, в 10 раз больше. Сконструированы специальные культиваторы, в которых развернута поверхность роста находится в подвижном состоянии, что обеспечивает вращение культур.
Отдельным подходом в культивировании клеток является выращивание клеток на носителях, в качестве которых используют стеклянные трубки, шарики, гранулы сефадекса, пластиковые зерна, спирали и др. Созданы аппараты, в которых площадь роста увеличивается за счет неподвижно расположенных сфер диаметром 3-10 мм или коротких сегментов трубок, горизонтально расположенных пластин, полупроницаемых клеток. Оптимальные условия для роста клеток создаются путем перфузии среды между элементами посадки.
Способ культивирования клеток на микроносителях является оптимальной комбинацией: с помощью технологии суспензионных культур выращиваются поверхностнозависимые клетки. Центральной проблемой является подбор материала носителя: используются различные пластикаты, металлы, стекла. Для управления процессом необходимо исследование кинетики роста клеток на микроносителях и анализ гидродинамической обстановки.
Таким образом, современный этап характеризуется развитием эффективных крупномасштабных систем культивирования клеток человека и животных, производства аппаратуры – культиваторов, а также самих клеток, питательных сред, широким внедрением асептических методов работы, использованием кинетических схем контроля основных характеристик, в том числе антигенности культивируемых клеток.
Проблема обеспечения оптимальных условий культивирования клеток человека и животных вне организма ещё далека от решения.
Создание способа крупномасштабного культивирования клеток вне организма открыло возможность в получении медикаментов, клеточных метаболитов и других ценных веществ с заданными свойствами [1].
3 Крупномасштабное выращивание клеток и тканей человека и животного
При культивировании учитываются разные параметры. Это константные параметры – качество материала, форма и объем культуры. Это вариабельные параметры скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер посевного материала, рН, t, О2, СО2, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания среды.
Для органных зоокультур используются естественные среды:
1) коагулянты – сгусток плазмы;
2) биологические жидкости – сыворотка, амниотическая, асцитическая жидкость и др.;
3) тканевые экстракты, например, эмбриональный экстракт.
Широко применяется в промышленности ряд синтетических сред, в основе которых имеется смесь неорганических солей – физиологический или сбалансированный солевой раствор. Функция этого раствора заключается в сохранении рН и осмотического давления среды, а также в обеспечении биологического агента необходимыми неорганическими веществами. Все среды содержат низкомолекулярные вещества, причем, число ингредиентов превышает 50, в их числе глюкоза, необходимые аминокислоты, витамины и др.
Наиболее широко применяемыми синтетическими средами являются среда 199, среда Игла, ВМЕ, среда Маккоя, среда RPM1, среда Финкера и др.
В некоторых случаях к синтетическим средам добавляют биологические жидкости: сыворотка, тканевые экстракты и др. Они обеспечивают клетки гормонами (кортикоиды, инсулин, половые гормоны, простогландины и др.), ростовыми факторами (эпидермиальным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленекротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибринонектин, ламинин – из мышиной саркомы), белками (альбумин, трансферрин, фетуин 0,2% N-ацетилнейраминовой кислоты), микроэлементами, липидами, и другими БАВ для выращивания in vitro. Обычно используются фетальную бычью сыворотку (ФБС), а также сыворотки фирмы «Sigma» (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, менее 10-месячного возраста, а также лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови [2].
Вместо натуральных сывороток фирма IВF biotechnics (Германия) предлагает высококачественные заменители, в частности, ultroser G – для иммобилизованных клеток. Эта среда содержит мало белка, благодаря чему упрощается очистка биопродукта и достигается стабильность компонентного состава.
Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру в пределах +36 +37,5°С. Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем [(СО2–NaHCO3) триси др.], а температуру с помощью терморегуляторов.
Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).
Посевной материал заметно сказывается на скорости роста клеток в монослойной культуре. В случае применения первичных клеток необходимо использовать посевной материал 6олее высокой плотности на 1 см3внутренней (рабочей) поверхности культиватора.
Если же используют клеточные линии (а не первичные клетки), то плотность инокулята может быть несколько меньшей, так как почти все 10% адгезируются на поверхности культиватора. Покачивание или вращение омываемых средой клеток несомненно сказывается на их прикреплении. Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне адаптированы к условиям выращивания in vitro. В 1964 г. впервые были получены линии соединительнотканных клеток фибробластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются неограниченно долго и первоначально использовались для репродукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин.
Используют клетки почек кроликов, обезьян, собак, 10-14-дневных куриных эмбрионов, клетки из миндалин, аминона, легких эмбриона человека 12-16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого человека, мышечные фибробласты и др. нормальные диплоидные клетки человека могут делиться ограниченное число раз (50-10) и проявляют феномен старения. В то же время такие клетки как Hela, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека, оказывались бессмертными при пассировании.
Клетки выращивают в строго асептичных условиях в специальном оборудовании при медленном вращении роллерной системы и покачивании для омывания большей площади культуральной среды. Клетки погружаются то в жидкую фазу, то в газообразную, для обеспечения дыхательной потребности в О2.
Глубинное выращивание клеток человека и животных в монослое. При глубинном культивировании клеток применяют следующие условия рН 7,2 – 7,4, t = 36-37,5 оC. Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по определению общего белка) [5].
Посевной материал и его качество сказываются на скорости роста клеток.
Когда клетки вырастут, жидкую фракцию сливают, клетки промывают изотоническим раствором поваренной соли, добавляют свежую.
Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах. Главное отличие – использование микроносителей, которые увеличивают площадь выращенных клеток. Микроносители суспендируются в питательной среде и на их поверхности закрепляются клетки, а затем разрастаются в виде монослоя. Данный метод представляет собой усовершенствованный вариант глубинного выращивания клеток человека и животных в монослое.
В качестве микроносителей применяют положительно заряженные ДЕАЕ – сефадексы, сефадексы с коллагеновым покрытием, отрицательно заряженный полистирол, полые стеклянные сферы, микросферы из пористого шлачного стекла. Поры их доступны для пенетрации (лат. Penetratio – проникновение) клеток внутрь матрикса. Пористые сферы пригодны для иммобилизации прилипающих и суспензионных клеток (например, гибридом).
Рекомендуемый размер носителей 200-25 мкм. Требуемое количество их равно 104/мл, а для инокуляции необходимо порядка 105 клеток. При увеличении количества микроносителя возрастает доза клеток в инокуляте.
Выбор сред и параметры остаются прежними. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе в градиенте плотности), фильтрованием или, чаще, обработкой трипсином с последующим промыванием и сепарированием [3].
При культивировании клеток в среду добавляют белки сыворотки крови, которые играют роль защитной матрицы – животные клетки имеют высокую ранимость по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов животных клеток во многом аналогичны микробной биотехнологии. Например, система культивирования одинакова: хемоили турбидистатные, периодические (циклические), непрерывные и полунепрерывные процессы.
Глубинное выращивание клеток животных в инкапсулированном состоянии. В противоположительность суспензионным культурам клеток на микроносителях разрабатываются способы инкапсулирования их в полимерные среды (полилизиновые, агарозные, изоиолимерные слои). В этом случае клетки не испытывают большого механического напряжения, которые они должны использовать в свободном виде.
Глубинное выращивание животных клеток реализуют в трех вариантах:
1. монослой клеток статичен, культуральная фаза подвижна;
2. среда культивирования статична, монослой клеток подвижен;
3. клетки (например, на микроносителе в микросферах) и среда культивирования подвижна.
Эти варианты надо иметь в виду при выборе технологии и проектировании оборудования.
В опытно-промышленных условиях получают интерферон, выращивая микробласты человека в виде отъемнодоливных культур, т.е. когда определенная часть клеточной суспензии замещается свежей средой, например, ultroser HY (Германия), а оставшаяся часть «старой» культуры выполняет роль инокулята.
Естественно, что время, затрачиваемое на подготовку смежных циклов и их реализацию при периодическом культивировании, является непроизводительным [1].
Метод органной зоокультуры претерпел значительные изменения и в настоящее время широко распространен. Широкое распространение метода привело к увеличению числа линий клеток, внешне трудно отличимых. Опыт работы с культурами клеток в разных лабораториях мира показал высокую вероятность контаминации клеток не только посторонними микроорганизмами, но и контаминации клеток клетками других линий.
Эта проблема актуальна при наличии нескольких линий клеток в лаборатории, особенно занимающейся получением собственных культур. Использование культур клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых научных результатов.
