Добрый день, друзья и коллеги! Представляю вашему вниманию мою научную статью об исследовании, которое я проводила с 2014-2019 года. Эта работа выиграла в Российском научном конкурсе РОСТ 2014, и мы отправились на международный конкурс Intel ISEF 2015 в г. Питтсбург, США. Нашу работу оценили на высоком уровне ученые и Лауреаты Нобелевской Премии. Приятного прочтения!
По данным ВОЗ 2014-2019 года свободно-радикальные патологии, в том числе сердечно-сосудистых заболевания, диабет и рак, лидируют среди основных причин смертности населения. В качестве индикатора свободно-радикальных патологий можно использовать уровень повреждения ДНК в клетках. Определять степень повреждения генетического материала в отдельных ядросодержащих клетках позволяет метод ДНК-комет. Он появился в научных лабораториях около 30 лет назад, но до сегодняшнего времени применяется только для решения фундаментальных задач. Метод комета тест не распространен в клинических лабораториях. Основным препятствием является использование высокотехнологичного оборудования с использованием гамма-излучения. В данной работе в качестве альтернативы гамма-излучению предложен озон.
Целью данный работы является оценить возможность применения озона для создания повреждений ДНК.
В эксперименте были использованы образцы венозной крови 8 белых интактных нелинейных крыс, самцов в возрасте 3,5 месяцев и 8 белых нелинейных крыс с экспериментальной опухолью. Из каждого образца крови готовилось по 8 слайдов: 2 не подвергался воздействию – это проба контроль, 6 слайдов обрабатывались раствором фосфатного буфера в объеме 50 мл в течение 5 минут, через который предварительно осуществляли барботирование озон-кислородной смеси при концентрации озона 200, 400 и 900 мкг/л в течение 10 мин. Анализировалось по 50 «комет» на слайд.
Уровень повреждений ДНК оценивали с помощью комета теста. Метод ДНК-комет основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. Метод включает 7 этапов: 1) приготовление слайдов, содержащих клетки, иммобилизованные в агарозу; 2) создание окислительного стресса в индивидуальных клетках на слайдах; 3) лизис клеток; 4) помещение слайдов в щелочной раствор для денатурации ДНК; 5) проведение электрофореза в щелочных условиях ; 6) окрашивание ДНК флуоресцентным красителем и визуализация комет; 7) анализ результатов. Анализ изображений проводится с помощью программы comet.exe.
Наши результаты показывают, что уровень диффузии хвоста ДНК-комет при воздействии озоном в концентрации 900 мкг/л в течение 10 минут сопоставим с уровнем диффузии хвоста ДНК-комет при воздействии гамма-излучения 60Co в дозе 3 Гр.
На втором этапе исследования в экспериментах с использованием перевивного опухолевого штамма холангиомы РС1 на лабораторных крысах установили, что уровень диффузии хвоста ДНК-комет клеток крови на ранних сроках роста опухоли статистически значимо ниже, чем на поздних.
Таким образом, во-первых, разработан новый способ создания повреждений ДНК для комета теста. Во-вторых, показана возможность широкого внедрения новой версии теста ДНК комет в скрининг-программы для выявления групп риска больных с СРП. Мы позволим делать ежегодно на 1 млн. комета тестов больше, чем раньше и облегчим страдания от химиотерапии в результате внедрения индивидуальных программ лечения почти 400 тыс. человек.
